Фолдинг белка реферат: «Структура и функциональная роль шаперонов в фолдинге белков», Медицина

Содержание

41. Фолдинг белков. Ферменты. Роль шаперонов в фолдинге белка. Фолдинг белковой молекулы с помощью шаперониновой системы. Болезни, связанные с нарушением фолдинга белка – прионовые болезни.

В
процессе синтеза полипептидных цепей,
транспорта их через мембраны, при сборке
олигомерных белков возникают промежуточные
нестабильные конформации, склонные к
агрегации. На вновь синтезированном
полипептиде имеется множество гидрофобных
радикалов, которые в трёхмерной структуре
спрятаны внутри молекулы. Поэтому на
время формирования нативной конформации
реакционно-способные аминокислотные
остатки одних белков должны быть отделены
от таких же групп других белков.

Во
всех известных организмах от прокариотов
до высших эукариотов обнаружены белки,
способные связываться с белками,
находящимися в неустойчивом, склонном
к агрегации состоянии. Они способны
стабилизировать их конформацию,
обеспечивая фолдинг белков. Эти белки
получили название «шапероны».

1.
Классификации шаперонов (Ш)

В
соответствии с молекулярной массой все
шапероны можно разделить на 6 основных
групп:

  • высокомолекулярные,
    с молекулярной массой от 100 до 110 кД;

  • Ш-90
    — с молекулярной массой от 83 до 90 кД;

  • Ш-70
    — с молекулярной массой от 66 до 78 кД;

  • Ш-60;

  • Ш-40;

  • низкомолекулярные
    шапероны с молекулярной массой от 15 до
    30 кД.

Среди
шаперонов различают: конститутивные
белки (высокий базальный синтез которых
не зависит от стрессовых воздействий
на клетки организма), и индуцибельные,
синтез которых в нормальных условиях
идёт слабо, но при стрессовых воздействиях
на клетку резко увеличивается.
Индуцибельные шапероны относят к «белкам
теплового шока», быстрый синтез
которых отмечают практически во всех
клетках, которые подвергаются любым
стрессовым воздействиям. Название
«белки теплового шока» возникло в
результате того, что впервые эти белки
были обнаружены в клетках, которые
подвергались воздействию высокой
температуры.

2.
Роль шаперонов в фолдинге белков

При
синтезе белков N-концевая область
полипептида синтезируется раньше, чем
С-концевая область. Для формирования
конформации белка нужна его полная
аминокислотная последовательность.
Поэтому в период синтеза белка на
рибосоме защиту реакционно-способных
радикалов (особенно гидрофобных)
осуществляют Ш-70.

Ш-70
— высококонсервативный класс белков,
который присутствует во всех отделах
клетки: цитоплазме, ядре, ЭР, митохондриях.
В области карбоксильного конца
единственной полипептидной цепи
шаперонов есть участок, образованный
радикалами аминокислот в форме бороздки.
Он способен взаимодействовать с участками
белковых молекул и развёрнутых
полипептидных цепей длиной в 7-9
аминокислот, обогащённых гидрофобными
радикалами. В синтезирующейся полипептидной
цепи такие участки встречают примерно
через каждые 16 аминокислот.

Фолдинг
многих высокомолекулярных белков,
имеющих сложную конформацию (например,
доменное строение), осуществляется в
специальном пространстве, сформированном
Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомернoго
комплекса, состоящего из 14 субъединиц
(рис. 1-23).

Ш-60
образуют 2 кольца, каждое из которых
состоит из 7 субъединиц, соединённых
друг с другом. Субъединица Ш-60 состоит
из 3 доменов: апикального (верхушечного),
промежуточного и экваториального.
Верхушечный домен имеет ряд гидрофобных
остатков, обращённых в полость кольца,
сформированного субъединицами.
Экваториальный домен имеет участок
связывания с АТФ и обладает АТФ-азной
активностью, т.е. способен гидролизовать
АТФ до АДФ и Н3РО4.

Шапероновый
комплекс имеет высокое сродство к
белкам, на поверхности которых есть
элементы, характерные для несвёрнутых
молекул (прежде всего участки, обогащённые
гидрофобными радикалами). Попадая в
полость шаперонового комплекса, белок
связывается с гидрофобными радикалами
апикальных участков Ш-60. В специфической
среде этой полости, в изоляции от других
молекул клетки происходит перебор
возможных конформации белка, пока не
будет найдена единственная, энергетически
наиболее выгодная конформация.

Высвобождение
белка со сформированной нативной
конформацией сопровождается гидролизом
АТФ в экваториальном домене. Если белок
не приобрёл нативной конформации, то
он вступает в повторную связь с шапероновым
комплексом. Такой шаперонзависимый
фолдинг белков требует затрат большого
количества энергии.

Таким
образом, синтез и фолдинг белков протекают
при участии разных групп шаперонов,
препятствующих нежелательным
взаимодействиям белков с другими
молекулами клетки и сопровождающих их
до окончательного формирования нативной
структуры .

4.
Болезни, связанные с нарушением
фолдинга
белков

Расчёты
показали, что лишь небольшая часть
теоретически возможных вариантов
полипептидных цепей может принимать
одну стабильную пространственную
структуру. Большинство же таких белков
может принимать множество конформаций
с примерно одинаковой энергией Гиббса,
но с различными свойствами. Первичная
структура большинства известных белков,
отобранных эволюцией, обеспечивает
исключительную стабильность одной
конформаций.

Однако
некоторые растворимые в воде белки при
изменении условий могут приобретать
конформацию плохо растворимых, способных
к агрегации молекул, образующих в клетках
фибриллярные отложения, именуемые
амилоидом (от лат. amylum
— 
крахмал).
Так же как и крахмал, амилоидные отложения
выявляют при окраске ткани йодом. Это
может происходить:

  • при
    гиперпродукции некоторых белков, в
    результате чего увеличивается их
    концентрация в клетке;

  • при
    попадании в клетки или образовании в
    них белков, способных влиять на
    конформацию других молекул белка;

  • при
    активации протеолиза нормальных белков
    организма, с образованием нерастворимых,
    склонных к агрегации фрагментов;

  • в
    результате точечных мутаций в структуре
    белка.

В
результате отложения амилоида в органах
и тканях нарушаются структура и функция
клеток, наблюдают их дегенеративные
изменения и разрастание соединительнотканных
или глиальных клеток. Развиваются
болезни, называемые амилоидрзами. Для
каждого вида амилоидоза характерен
определённый тип амилоида. В настоящее
время описано более 15 таких болезней.

Болезнь
Альцхаймера

Болезнь
Альцхаймера — наиболее часто отмечаемый
?-амилоидоз нервной системы, как правило,
поражающий лиц преклонного возраста и
характеризующийся прогрессирующим
расстройством памяти и полной деградацией
личности. В ткани мозга откладывается
?-амилоид — белок, образующий нерастворимые
фибриллы, нарушающие структуру и функции
нервных клеток. ?-амилоид — продукт
изменения конформаций нормального
белка организма человека. Он образуется
из более крупного предшественника
частичным протеолизом и синтезируется
во многих тканях. ?-Амилоид, в отличие
от своего нормального предшественника,
содержащего много ?-спиральных участков,
имеет вторичную ?-складчатую структуру,
агрегирует с образованием нерастворимых
фибрилл, устойчив к действию протеолитических
ферментов.

Причины
нарушения фолдинга нативных белков в
ткани мозга ещё предстоит выяснить.
Возможно, с возрастом уменьшается синтез
шаперонов, способных участвовать в
формировании и поддержании нативной
конформаций белков, или увеличивается
активность протеаз, что приводит к
увеличению концентрации белков, склонных
изменять конформацию.

Прионовые
болезни

Прионы
— особый класс белков, обладающих
инфекционными свойствами. Попадая в
организм человека или спонтанно возникая
в нём, они способны вызывать тяжёлые
неизлечимые заболевания ЦНС, называемые
прионовыми болезнями. Название «прионы»
происходит от аббревиатуры английской
фразы proteinaceous
infectious particle 

белковая инфекционная частица.

Прионовый
белок кодируется тем же тленом, что и
его нормальный аналог, т.е. они имеют
идентичную первичную структуру. Однако
два белка обладают различной конформацией:
прионовый белок характеризуется высоким
содержанием ?-слоёв, в то время как
нормальный белок имеет много ?-спиральных
участков. Кроме того, прионовый белок
обладает устойчивостью к действию
протеаз и, попадая в ткань мозга или
образуясь там спонтанно, способствует
превращению нормального белка в прионовый
в результате межбелковых взаимодействий.
Образуется так называемое «ядро
полимеризации», состоящее из
агрегированных прионовых белков, к
которому способны присоединяться новые
молекулы нормального белка. В результате
в их пространственной структуре
происходят конформационные перестройки,
характерные для прионовых белков.

Известны
случаи наследственных форм прионовых
болезней, вызванных мутациями в структуре
данного белка. Однако возможно и заражение
человека прионовыми белками, в результате
чего возникает заболевание, приводящее
к гибели больного. Так, куру — прионовая
болезнь аборигенов Новой Гвинеи,
эпидемический характер которой связан
с традиционным каннибализмом в этих
племенах и передачей инфекционного
белка от одной особи к другой. В связи
с изменением образа их жизни данное
заболевание практически исчезло.

Шапероны и их роль в фолдинге белков

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации» ФГБОУ ВО Новосибирский ГАУ Биолого-технологический факультет Кафедра ветеринарной генетики и биотехнологии КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА по дисциплине «Молекулярная биология», на тему «Шапероны и их роль в фолдинге белков» Выполнила: Студентка гр. 2404 Овчинникова Ксения Олеговна Проверила: д.б.н., профессор Короткевич Ольга Сергеевна НОВОСИБИРСК 2017 Содержание Введение……………… ии нина 3

Классификация шаперонов (11)…………. линии нии нииниииинииининининининии 4
Роль шаперонов в фолдинге белков…………….линииниииилинилининилининининиинилиа 5
Заключение………… линии лилии или ии или 7

Список использованной литературы 8

Роль шаперонов в фолдинге белков Фолдингом белка называется процесс спонтанного сворачивания полипептидной цепи в уникальную нативную пространственную структуру (третичную). Шапероны фолдинга – молекулы, которые необходимы для изменения формы белка. При синтезе белков C-концевая область полипептида синтезируется позже, чем N-концевая часть. Для образования белковой конформации нужна его полная аминокислотная последовательность. Потому в период белкового синтеза на рибосоме защиту реакционно-способных радикалов (особенно гидрофобных) осуществляют Ш-70. Ш-70 – это класс высококонсервативных белков, который находится во всех отделах клетки: ядре, митохондриях, цитоплазме. В области карбоксильного конца единственной полипептидной цепи шаперонов есть участок, сформированный аминокислотными радикалами в форме бороздки. Он может взаимодействовать с участками молекул белков и развёрнутых полипептидных цепей длиной от 7 до 9 аминокислот, обогащённых гидрофобными радикалами. В полипептидной цепи, которая синтезируется, такие участки встречаются в среднем через каждые 16 аминокислот. Фолдинг многих высокомолекулярных белков, которые имеют сложную конформацию (например, доменное строение), осуществляется в особом пространстве, созданном Ш-60. Ш-60 действуют в виде олигомерного комплекса, складывающегося из 14 субъединиц. Ш-60 формируют 2 кольца, каждое из которых состоит из 7 субъединиц, связанных между собой. Субъединица Ш-60 состоит из 3 доменов: апикального (верхушечного), промежуточного и экваториального. Апикальный домен имеет ряд гидрофобных остатков, направленных в полость кольца, образованного субъединицами. В экваториальном домене имеется участок связывания с АТФ, также домен обладает АТФ-азной активностью, то есть способен гидролизовать АТФ до АДФ и Н3РО4. Шапероновый комплекс имеет высокое сходство с белками, на поверхности которых имеются элементы, которые характерны для несвёрнутых молекул (прежде всего участки, обогащённые гидрофобными радикалами). После попадания в полость шаперонового комплекса, белок начинает связываться с гидрофобными радикалами верхушечных участков Ш-60. В специфической среде этой полости, в изоляции от других молекул клетки протекает выбор домустимых конформаций белка, пока не найдется единственная, энергетически выгодная конформация. Белок высвобождается со сформированной нативной конформацией и сопровождается в экваториальном домене гидролизом АТФ. Если белок не приобрёл нативную конформацию, то он вступает в повторную связь с шапероновым комплексом, такой шаперонзависимый фолдинг белков требует большего количества энергии. Таким образом, фолдинг и синтез белков проходит при участии разных групп шаперонов, которые препятствуют нежелательным взаимодействиям белков с другими молекулами клетки и сопровождающих их до конечного образования нативной структуры. Заключение Механизм, при котором белки сворачиваются, изучен не до конца. Экспериментальное установление трёхмерной структуры белка зачастую сложно и дорого, однако аминокислотная последовательность белка в большинстве случаев известна. Поэтому учёные стараются применять разные биофизические методы, для того, чтобы спрогнозировать пространственную структуру белка из первичной аминокислотной последовательности.

«Шапероны разных семейств в фолдинге белка», Медицина

Функционирование шаперонов в клетках прокариот и эукариот не имеет принципиальных отличий. Совокупные пути шаперонзависимого фолдинга белка-мишени в клетке E. coli схематически представлены на рис. 5.

белок клетка полипептидный шаперон.

Рис. 5.

Высвобождающаяся из рибосомного туннеля полипептидная цепь встречается с TF-шапероном, а затем — с системой Hsp70 (DnaK-DnaJ-GrpE) (1), промотирующей фолдинг либо до нативного состояния (NP) (2), либо до белка в частично свернутой конформации (промежуточная форма IP) (3). Завершение фолдинга ненативного полипептида IP может происходить по двум направлениям: путем повторного взаимодействия с системой Hsp70 (4), которое может включать стадию стабилизации белка IP связыванием его с малыми белками теплового шока sHsps (4′, 4″), или путем взаимодействия с системой шаперонина Hsp60 (GroEL-GroES) (5). Кроме того, белок IP может агрегировать (6) с образованием формы AgP (эта же форма может образоваться из нативного белка в условиях теплового стресса (7)-(6)) или подвергнуться энергозависимому протеолизу (8). Дезагрегация белка AgP Hsp100-шапероном ClpB в кооперации с системой Hsp70 (9) и последующий рефолдинг развернутого белка (UfP) завершает сворачивание мишени. Считается, что сворачивание белков небольших размеров может осуществляться котрансляционно с участием только фактора TF. Для фолдинга белков среднего размера (25−60 кДа) помимо фактора TF необходима система Hsp70 и, в ряде случаев, шаперонины Hsp60, функционирующие по цис-механизму. В формировании структуры крупных мультидоменных белков участвуют шапероны всех семейств, при этом взаимодействие 12шаперонинов Hsp60 с белком-мишенью происходит по транс-механизму.

Крайне важно подчеркнуть, что кооперация шаперонов разных семейств позволяет не только ремоделировать белки разного размера, но и преодолеть эффектКроме участия в формировании трехмерной структуры белков и ренативации частично денатурированных белков, шапероны также необходимы для протекания таких фундаментальных процессов, как сборка олигомерных белков, узнавание и транспорт в лизосомы денатурированных белков, транспорт белков через мембраны, участие в регуляции активности белковых комплексов.

Молекулярные шапероны и их роль в фолдинге полипептидов

МИНИСТЕРСТВО   Рублева И   сбывать РОССИЙСКОЙ   рыбфлот ФЕДЕРАЛЬНОЕ   ломящийся БЮДЖЕТНОЕ   опросить УЧРЕЖДЕНИЕ   неприключенческий ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО  пудрящий

КЕМЕРОВСКИЙ   разрешение УНИВЕРСИТЕТ

Реферат по  ил.

«Молекулярная  пасечник

на  проигрывать

«Молекулярные   косоглазо  и их   подхватывавшийся в   улечься белков»

                                                                                   отстраивать студентка  

                                                                                   сага Бм-161                                                                                                                                                                    

                                                                                   обугливавшийся А. В.

Кемерово  моментально

CОДЕРЖАНИЕ

CОДЕРЖАНИЕ        3

ВВЕДЕНИЕ        4

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ШАПЕРОНОВ И ИХ ФУНКЦИЙ        6

1.1 Происхождение шаперонов        6

1.2 Биологические функции молекулярных шаперонов        7

ГЛАВА 2. РОЛЬ ШАПЕРОНОВ В ФОЛДИНГЕ ПОЛИПЕПТИДОВ        8

2.1 Шапероны и фолдинг белков        8

2.2 Шапероны разных семейств в фолдинге белка        10

ЗАКЛЮЧЕНИЕ        12

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ        13


ВВЕДЕНИЕ

Исследования   газонокосилка денатурации и   шлакобетонный белков  in  курчавый  привели к   бутуз заключению,   проглатывание вся   наем и   обворовывающий информация о   раскреплять структуре   замарать заключена в   ткавшийся аминокислотной   кассирша [1].   догматично исследования   кайфовать жизнедеятельности   олух и   Зеленин белков  in  заглаженный  выявили   высокомерный клеточных  подзабыть нентов,   перепрофилирование вовлечены   сокровенно в   убивший процесса   необдуманно белков,   колесовать в   вырисовавший распреде  декабристский вновь   обезображение бел  спелеология между   прорезинить пу  одр сворачивания и   переложивший [ причисляемый

К   рядок 80-х   перекрываемый сложилось   общенациональный согласно   Армения определенные   перемотавший факторы   привносящийся играть   прочесавший важную   вояка в   надкостничный формирования и   сценарий нативной   расколотившийся белка в   заласканный На   Соколов имевшихся   нетолстый Эллисом   возбужденность была   интригующий идея  дюза    вдосталь белков в  нащупывавшийся воположность   самосмазка Эта   уродующий предполагает,   заблаговременно хотя   порожистый белков   нудящийся спонтанным   приработанный существуют   прессовать стадии, на   завивший участие   трахоматозный клеточных   замедливший может   отчество необходимым.   раскачанный таких   зообентос названных   попревший шаперонами,   дочитывавший в   однокубовый опти  плющение условий   рыбина протекания   обольщенный сворачивания   прессшпан путем   отмеривать  « наилегчайший »   ординатор  «  доспеть контактов».

Фолдинг. Биологическая химия

Фолдинг

Фолдинг белков – процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру. При этом происходит сближение удаленных аминокислотных остатков полипептидной цепи, приводящее к формированию нативной структуры. Эта структура обладает уникальной биологической активностью. Поэтому фолдинг является важной стадией преобразования генетической информации в механизмы функционирования клетки.

Структура и функциональная роль шаперонов в фолдинге белков

В процессе синтеза полипептидных цепей, транспорта их через мембраны, при сборке олигомерных белков возникают промежуточные нестабильные конформации, склонные к агрегации. На вновь синтезированном полипептиде имеется множество гидрофобных радикалов, которые в трёхмерной структуре спрятаны внутри молекулы. Поэтому на время формирования нативной конформации реакционноспособные аминокислотные остатки одних белков должны быть отделены от таких же групп других белков.

Во всех известных организмах от прокариотов до высших эукариотов обнаружены белки, способные связываться с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны стабилизировать их конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Эти белки получили название шаперонов.


Классификация шаперонов (Ш)

В соответствии с молекулярной массой все шапероны можно разделить на 6 основных групп:

1. высокомолекулярные, с молекулярной массой от 100 до 110 кДа;

2. Ш-90 – с молекулярной массой от 83 до 90 кДа;

3. Ш-70 – с молекулярной массой от 66 до 78 кДа;

4. Ш-60;

5. Ш-40;

6. Низкомолекулярные шапероны с молекулярной массой от 15 до 30 кДа.

Среди шаперонов различают: конститутивные белки (высокий базальный синтез которых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма), и индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идёт слабо, но при стрессовых воздействиях на клетку резко увеличивается. Индуцибельные шапероны относятся к «белкам теплового шока», быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым воздействиям. Название «белки теплового шока» возникло в результате того, что впервые эти белки были обнаружены в клетках, которые подвергались воздействию высокой температуры.

Роль шаперонов в фолдинге белков

При синтезе белков N-концевая область полипептида синтезируется раньше, чем С-концевая область. Для формирования конформации белка нужна его полная аминокислотная последовательность. Поэтому в период синтеза белка на рибосоме защиту реакционно-способных радикалов (особенно гидрофобных) осуществляют Ш-70.

Ш-70 – высококонсервативный класс белков, который присутствует во всех отделах клетки: цитоплазме, ядре, митохондриях.

Фолдинг многих высокомолекулярных белков, имеющих сложную конформацию (например, доменное строение), осуществляется в специальном пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомерного комплекса, состоящего из 14 субъединиц.

Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности которых есть элементы, характерные для несвёрнутых молекул (прежде всего участки, обогащённые гидрофобными радикалами). Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш-60. В специфической среде этой полости, в изоляции от других молекул клетки происходит выбор возможных конформаций белка, пока не будет найдена единственная, энергетически наиболее выгодная конформация.

Высвобождение белка со сформированной нативной конформацией сопровождается гидролизом АТФ в экваториальном домене. Если белок не приобрёл  нативной конформации, то он вступает в повторную связь с шапероновым комплексом. Такой шаперонзависимый фолдинг белков требует затрат большего количества энергии.

Таким образом, синтез и фолдинг белков протекает при участии разных групп шаперонов, препятствующих нежелательным взаимодействиям белков с другими молекулами клетки и сопровождающих их до окончательного формирования нативной структуры.

Роль шаперонов в защите белков клеток от денатурирующих стрессовых воздействий

Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих воздействий, как уже говорилось выше, относят к белкам теплового шока (БТШ) и в литературе часто обозначают как HSP (англ. heat shock protein).

При действии различных стрессовых факторов (высокая температура, гипоксия, инфекция, УФО, изменение рН среды, изменение молярности среды, действие токсичных химических веществ, тяжёлых металлов и т.д.) в клетках усиливается синтез БТШ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично денатурированных белков, они могут препятствовать их полной денатурации и восстанавливать нативную конформацию белков.

Установлено, что кратковременные стрессовые воздействия увеличивают выработку БТШ и повышают устойчивость организма к длительным стрессовым воздействиям. Так, кратковременная ишемия сердечной мышцы в период бега при умеренных тренировках значительно повышает устойчивость миокарда к длительной ишемии. В настоящее время перспективными исследованиями в медицине считают поиски фармакологических и молекулярно-биологических способов активации синтеза БТШ в клетках.

Болезни, связанные с нарушением фолдинга белков

Расчёты показали, что лишь небольшая часть теоретически возможных вариантов полипептидных цепей может принимать одну стабильную пространственную структуру. Большинство же таких белков может принимать множество конформаций с примерно одинаковой энергией Гиббса, но с различными свойствами. Первичная структура большинства известных белков, отобранных эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной конформации.

Однако некоторые растворимые в воде белки при изменении условий могут приобретать конформацию плохо растворимых, способных к агрегации молекул, образующих в клетках фибриллярные отложения, именуемые амилоидом (от лат. аmylum – крахмал). Так же, как и крахмал, амилоидные отложения выявляют при окраске ткани йодом.

Это может происходить:

1. при гиперпродукции некоторых белков, в результате чего увеличивается их концентрация в клетке;

2. при попадании в клетки или образовании в них белков, способных влиять на конформацию других молекул белка;

3. при активации протеолиза нормальных белков организма, с образованием нерастворимых, склонных к агрегации фрагментов;

4. в результате точечных мутаций в структуре белка.

В результате отложения амилоида в органах и тканях нарушаются структура и функция клеток, наблюдаются их дегенеративные изменения и разрастание соединительнотканных клеток. Развиваются болезни, называемые амилоидозами. Для каждого вида амилоидоза характерен определённый тип амилоида. В настоящее время описано более 15 таких болезней.







Данный текст является ознакомительным фрагментом.




Продолжение на ЛитРес








Белки теплового шока

Доклад на тему «Тепловой 
шок»

Выполнили: Магнушевская
Е.К., Умудова Э.И.

1
– слайд. Название.

2
– слайд. План

3
– слайд. Введение.

Все живые клетки
отвечают на повышение температуры 
и некоторые другие стрессовые воздействия 
синтезом специфического набора белков,
называемых белками теплового шока (БТШ).
У ряда бактерий обнаружена универсальная
адаптивная реакция в ответ на различные
стрессовые воздействия (высокие и низкие
температуры, резкий сдвиг рН и др.), проявляющаяся
в интенсивном синтезе небольшой группы
сходных белков. Такие белки получили
название белков теплового шока, а само
явление — синдром теплового шока.

Белки
теплового шока

(англ. HSP, Heat shock proteins) — это класс функционально
сходных белков, экспрессия которых усиливается
при повышении температуры или при других
стрессирующих клетку условиях.

Повышение экспрессии
генов, кодирующих белки теплового 
шока, регулируется на этапе транскрипции.
Чрезвычайное усиление экспрессии генов,
кодирующих белки теплового шока
является частью клеточного ответа на
тепловой шок и вызывается в основном
фактором теплового шока (HSF англ. heat shock
factor). Белки теплового шока обнаружены
в клетках практически всех живых организмов,
от бактерий до человека.

4
– слайд. Введение.

Этот  феномен 
свойственен  всем организмам,  и
его молекулярный  механизм  практически
идентичен у бактерий,  архей и эукариот.
При повышении температуры клетка начинает 
синтезировать белки теплового шока, 
к которым прежде  всего относятся
молекулярные  шапероны (DnaK, GroEL) 
и АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP).  Эти
белки выполняют две основные  функции
— обеспечивают  фолдинг (сворачивание 
в нативную  конформацию)  и деградацию
поврежденных  белков.  Несмотря 
на  полную противоположность этих 
двух  функций результат их осуществления
один – ликвидация поврежденных (и 
потенциально  опасных  для клетки) 
белков. Цитоплазматические  протеазы
по  своей  структуре  напоминают 
шапероны — древние машины для фолдинга.
И те, и другие распознают  экспонированные 
гидрофобные участки  неправильно 
свернутых  или денатурированных белков. 

5
– слайд. История 
открытия БТШ.

Открытие БТШ началось
с работ Ф. Ритоззы в 1962 году на
политенных хромосомах слюнных желез 
личинок дрозофилы. Политенными 
называются гигантские хромосомы, образованные
стопками параллельно упакованных гомологичных
нитей хроматина, которых может быть больше
1000. Это позволяет изучать политенные
хромосомы под световым микроскопом, различать
в них отдельные «диски», соответствующие
генам, и наблюдать, как при активации
генов плотная структура диска переходит
в «пуф» — вздутие, образующееся за
счет разрыхления структуры хроматина
в активном гене и накопления синтезирующихся
молекул РНК. Ф. Ритозза обнаружил, что
повышение температуры с 20 до 37С приводит
к образованию пуфов там, где они не появлялись
при нормальной температуре. Так были
открыты гены теплового шока. Правда, позднее
было обнаружено, что их можно активировать
рядом воздействий и при нормальной температуре.
Кодируемые этими генами белки были идентифицированы
только в 1974 году. Они получили название
БТШ. Вскоре выяснилось, что синтез БТШ
в ответ на увеличение температуры характерен
для клеток всех типов живых организмов:
бактерий, грибов, животных всех уровней
организации, человека, низших и высших
растений.

БТШ у всех организмов
представлены большим набором полипептидов,
и их принято именовать в соответствии
с молекулярной массой, выраженной
в килодальтонах (кД). Например, БТШ 
с молекулярной массой 70 кД называют
БТШ70. О существенной роли БТШ в 
жизни клеток говорит их высокая консервативность
в эволюции. Например, БТШ70 имеет высокое
сходство аминокислотной последовательности
у насекомых, птиц, млекопитающих, грибов
и растений. Отдельные участки в БТШ70 сохраняют
свыше 90% гомологии у бактерий и человека.

6
– слайд. Классификация 
БТШ.

Согласно современной
классификации, в основу которой положены
различия в молекулярных массах, выделяют
пять основных классов Hsp: Hsp100,90,70,60 и малые
Hsp. Каждый из этих классов белков выполняют
характерные функции. Так, белки семейства
Hsp70(как и их бактериальный аналог DnaK),
взаимодействуют с вновь синтезируемой
на рибосомах полипептидной цепью, предотвращая
преждевременное неправильное сворачивание
незрелой полипептидной цепи и участвуют
транспорте белка к определённым органеллам.
Белки класса Hsp100 являются близкими родственниками
белков теплового шока с молекулярной
массой 70кДа и выполняют защитную функцию,
предохраняя организм в условиях стресса.
Hsp90 образует сложный комплекс с несколькими
вспомогательными белками. Такой комплекс
взаимодействует с рецепторами стероидных
гормонов, обеспечивает эффективное связывание
гормона с рецепторами и последующий перенос
гормон – рецепторного комплекса в ядро.
Помимо этого, белки класса Hsp70 участвуют
в направленном переносе нескольких типов
протеинкиназ к участкам их функционирования.
Белки семейства Hsp60 могут учавствовать
в фолдинге сложно устроенных многодоменных
белков, а также в АТФ – зависимом исправлении
ошибок в структуре частично денатурированных
белков.

7
– слайд. Молекулярные
шапероны

Эти  белки  обеспечивают 
правильный фолдинг синтезируемых 
белков за счет энергии гидролиза 
АТФ.  Они  особенно  важны  у 
прокариот,  где  фолдинг  обычно 
не  является котрансляционным. 
Шапероны  могут  также вернуть 
в  нормальную  конформацию  многие
денатурированные  белки (накапливающиеся
при многих стрессах, включая тепловой
шок), а также предотвращают агрегацию
олигомеров и обеспечивают  их  разделение. 
Наконец, шапероны участвуют в секреции,
поддерживая секретируемые белки в развернутом
состоянии. Шапероны  из  семейств
Hsp70  и Hsp60 присутствуют  в  цитоплазме 
в наибольших  количествах.  Гомологом
Hsp60  у E. coli  является GroEL,  формирующий
гигантский  комплекс  с GroES,  в 
центральной полости  которого  целиком
может поместиться белок размером до 55
кДа. GroES-GroEL  комплекс  имеет существенное
сходство с эукариотической 26S протеосомой, 
ответственной  за  деградацию меченых
убихитином белков.  У E. coli гомологом
Hsp70 является DnaK, который  образует 
комплекс  с  кошапероном DnaJ и белком
GrpE. E. coli  также имеет дополнительные
шапероны ,  такие как SecB, ClpB  и IbpAB,
взаимодействующие с белками,  являющимися
плохими субстратами для шаперонов Hsp70 
и Hsp60 семейств.

8
– слайд. АТФ 
– зависимые протеазы.

В  отличие  от 
эукариот,  где множественные 
системы  мечения  белков убихитином 
направляют  различные  субстраты 
к  единственной  цитоплазматической 
протеазе (26S  протеазе),  за  распознавание 
субстрата  у прокариот отвечают
сами протеазы, поэтому их в  клетке, 
как  правило,  несколько (порядка
шести).  Энергозависимые  протеазы
представляют  собой,  как  правило,
крупные олигомерные  комплексы. 
Для  всех  протеаз этого  класса 
с  известной  структурой протеазные 
сайты  располагаются  во внутренней
камере олигомера, вход в которую слишком
мал для большинства нативных (свернутых) 
белков.  Поступление субстрата внутрь 
такой полости обеспечивается регульторными
АТФазными доменами (или субъединицами). 
Не  удивительно,  что именно АТФазные 
субъединицы  отвечают  за субстратную 
специфичность.  Аминокислотные последовательности 
АТФазных  субъединиц  разных протеаз 
имеют  сходство,  которое  может 
свидетельствовать  о  сходстве 
механизмов  их  действия. Поскольку
распознавание субстратов осуществляется
регуляторными АТФазами, свойства субстратов
приводящие  к  их  деградации, 
не  зависят  от  свойств,  необходимых 
для  разрезания  пептидных  связей.
Как  только  белок  распознается 
и  связывается  регуляторным 
АТФазным  доменом,  начинается последовательная
деградация полипептидной цепи с разрезами
через каждые 5-10 аминокислот

9
– слайд. АТФ 
– зависимые протеазы.

ClpAP ClpXP

У  этих  протеаз 
АТФазная  и  протеазная активность 
принадлежат  разным субъединицам, 
и  неудивительно,  что  эти субъединицы 
способны  действовать самостоятельно.
ClpA  и ClpX  могут действовать  как 
шапероны.  Гены clpX  и clpP составляют
оперон, clpA расположен отдельно в  моноцистронном 
опероне.  Оба  оперона имеют типичные
промоторы теплового шока.

HflB(FtsH)

Zn  и  АТФ-зависимая  
протеаза, участвующая  в  деградации 
цитоплазматических  и  мембранных 
белков, включая RpoH, SecY (часть аппарата 
секреции). Единственная АТФ-зависимая 
протеаза, существенная для жизни 
E. coli. В опероне с RpoH-зависимым
промотором.

Lon

Деградирует  белок
N  фага  λ,  ингибитор клеточного 
деления SulA,  позитивный регулятор 
биосинтеза  капсулы RcsA  и  др.
Кроме  специфических  мишеней, Lon
деградирует  большинство  аномальных 
белков E. coli.  Белок –  гомотетрамер, 
имеет  сайты связывания  с АТФ и
ДНК, причем  связывание с  ДНК 
стимулирует  протеазную  активность.
Транскрибируется  с  промотора 
теплового шока.  В  белке  можно 
выделить  два  домена – собственно 
протеазный  с  карбоксильного конца
с сериновым остатком в активном сайте
и  следующий  за  ним  АТФазный.
Экспериментально  показано,  что 
эти  два домена  могут  быть 
экспрессированы  как отдельные 
полипептиды,  смесь  которых функционально 
соответствует  интактной протеазе
Lon.

10
– слайд. Регуляция
теплового шока у B. subtilis

Гены 
первого класса

(регулон CIRCE/HrcA) кодируют синтез основных
шаперонов DnaKJ-GrpE и GroEL-GroES,  и их  экспрессия 
негативно контролируется  репрессором
HrcA,  первым  геном оперона DnaK. Действие 
этого репрессора  осуществляется 
через связывание  с оператором –
инвертированным повтором CIRCE. Контроль 
этого регулона  осуществляется при
участии шаперонов GroEL-GroES.  Этот 
шаперон необходим для фолдинга HrcA, 
а титрование шаперона образующимися
в стрессовых условиях аномальными белками
приводит к снижению активности HrcA — 24
и усилению экспрессии оперонов GroE и DnaK.
Таким образом, у грамположительных бактерий
GroE, а не DnaK играет основную роль в регуляции
теплового шока. Репрессор HrcA  и CIRCE-элементы 
быки  обнаружены  не  только 
у  грамположительных,  но  и 
у альфа-протеобактерий,  цианобактерий, 
хламидий  и  спирохет,  однако 
их  роль  в  регуляции теплового
шока варьирует. 

Кo
второму классу

относится большая группа (50-100) генов,
позитивно контролируемых сигма-фактором 
общего  стресса σB,  которые  кроме 
тепла  индуцируются  еще  и 
голоданием  по  глюкозе  или кислороду.  
Этот  сигма-фактор  регулируется 
сложным  каскадом  белок-белковых 
взаимодействий (включая фосфорилирование). 

К
третьему классу
относятся все остальные
гены, не имеющие общей системы регуляции.

11
– слайд. Hsp70.

Одними из первых
шаперонов стал БТШ Hsp70. Белки этого
семейства объединяют одинаковая молекулярная
масса и гомология N – концевого фрагмента.
Последняя достигает 50% у бактериального
DnaK и Hsp70 человека. В одной клетке высших
можно одновременно встретить несколько
компонентов семейства Hsp70: индуцибельный
Hsp70, миохондриальный Mtp70 и резидент эндоплазмотического
ретикулума Grp78.

Члены семейства 
белков теплового шока Hsp70 можно считать
одними из самых первых открытых шаперонов,
и к настоящему времени достаточно хорошо
изучен шаперонный механизм, основанный
на этих белках. С помощью этого механизма
он выполняет двойственную роль: исправляет
структуру вновь синтезированных или
повреждённых полипептидов или способствует
деградации «неисправимых» белков в протеасомах.

Функции: защитная и 
иммуномодулирующая.

12
– слайд. Hsp70.

Анализ последовательности
гена и позднее структуры самого
белка Hsp70 с помощью метода малоуголового
рентгеновского рассеяния показал, что
молекула Hsp70 молекула Hsp70 состоит из двух
доменов – АТФ- и пептидсвязывающего,
занимающего соответственно N – C – концевые
фрагменты молекулы.

В состав семейства
Hsp70 входят белки – помощники такие как:

  1. Белки содержащие
    J – домен: Hdj1/Hsp40, Hdj2 (узнаёт и связывает
    белок с измененной структурой и передаёт
    последней Hsp70)
  2. Нуклеотид – обменщик
    Bag–1 и Hip
  3. Фактор связывания
    шаперонов Hsp70 и Hsp90 Hop

    (Шаперонный аппарат 
    работает след. Образом. Кошаперон Hdj1
    или Hdj2 узнаёт и связывает белок с изменой
    структурой и передаёт последний Hsp70. Шаперон
    в момент связывания находится с АТФ форме,
    т.е. в промежуточном состоянии, в котором
    он может отпустить субстрат или может
    вступить с ним в достаточно жёсткий комплекс.
    В первом случае шаперон не находит никаких
    изъянов в молекуле субстратного полипептида,
    а во втором такие изъяны, точнее экспонированные
    гидрофобные участки, имеются. Процесс
    захвата субстрата контролируется каким
    – либо из белков, содержащих J – домен,
    например Hdj1, который, связывается с АТФазным
    доменом и С – концевой последовательностью
    аминокислот EEVD, изменяет конформацию
    Hsp70; при этом происходят инициация АТФазы
    шаперона и гидролиз АТФ и комплекс субстрата
    с Hsp70 в FLA – связанной форме становятся
    устойчивым. Для высвобождения полипептид
    отходит, а Hsp70 переходит в промежуточное
    состояние. Дальнейшая судьба освобождённого
    полипептида зависит от того, насколько
    его структура выправилась, и в этом плане
    имеется несколько сценариев. Во – первых,
    белок, обретший правильную с точки зрения
    клетки форму, может транспортироваться
    в органеллы, где он должен функционировать.
    Во – вторых, в случае недостаточной эффективности
    исправления структуры белка он подвергается
    повторному шаперонированию в основных
    системах на Hsp70 – Hsp9)

  1. CHIP. ( В середине
    1990-х годов появились данные о том, что
    Hsp70 участвует в направленной деградации
    белков в 26S – протеасомах. Деградация
    белков в этих частицах достаточна специфична,
    и субстратами служат меченные убиквитином
    белки. Было установлено, что кошаперон
    Bag – 1 участвует в доставке белковых субстратов
    в протеасомы и что в этот процесс вовлечён
    ещё один белок CHIP. В молекуле CHIP имеется
    мотив TRP, который необходим для взаимодействия
    белка с С – терминальными областями молекул
    шаперонов hsp70 и Hsp90 Избыточная экспрессия
    CHIP приводит к подавлению шаперонной активности
    Hsp70 специфически на этапе её инициации
    белком Hdj1 )

13
– слайд. Hsp70.

Основной шаперон
Hsp70 с помощью кошаперонов Hdj1 и Bag – 1 осуществляет
цикл связывания – освобождения субстратных
полипептидов. Обмен АТФ – FLA действует
как переключатель конформации Hsp70 до
того, как полипептид приобретает свёрнутую
форму и шаперон перестаёт его узнавать
в качестве субстрата, или до того, как
CHIP связывается с комплексом Hsp70 – субстрат.
Bag – 1 индуцирует освобождение субстратного
пептида из молекулы Hsp70 зависимым от АТФ
образом. В то же время CHIP поддерживает
шаперон в АТФ – связанном состоянии и
каталмзирует убиквитинилирование субстратного
белка, отходящего от Hsp70 при содействии
Bag – 1.

Белки — шапероны

ГБОУ ВПО Уральская 
государственная медицинская академия

Министерство здравоохранения 
и социального развития Российской
Федерации

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат

«Белки — шапероны»

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                             
Выполнила: студентка группы ОП 
– 110

                                                       
Беляева П. А.

                                             
Преподаватель: Каминская Л. А.

 

Екатеринбург, 2013

Содержание:

  1. Введение
  2. История открытия
  3. Свойства
  4. Функции
  5. Применение в медицине
  6. Заключение
  7. Список литературы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Шапероны (англ. chaperones) — 
класс белков, основная функция которых
состоит в восстановлении правильной
третичной структуры повреждённых белков,
а также образование и диссоциация белковых
комплексов. Термин «молекулярный шаперон»
впервые был использован в 1978 году в работе
Рона Ласкей, профессора эмбриологии из
Кембриджского Университета при описании
ядерного белка — нуклеоплазмина, способного
предотвращать агрегирование белков —
гистонов с ДНК при образовании нуклеосом.
Шапероны есть во всех живых организмах,
и механизм их действия, нековалентное
присоединение к белкам и их «расплетение»
с использованием энергии гидролиза АТФ
также консервативен.

Термин шаперон используется
в клеточной биологии применительно 
к группе белков, предотвращающих 
нежелательные контакты между другими 
белками. Такие контакты могут оказаться 
особенно опасными во время синтеза 
белка – процесса, происходящего 
в рибосомах клетки. Образующаяся
в рибосоме цепочка из 20 различных 
аминокислот находится в туннеле 
и не появляется оттуда, пока не достигнет 
определенной длины.

 

 

 

 

 

 

 

История открытия

В 1974 году Тиссиерес и соавт.
впервые обнаружили, что в ответ на повышение
температуры среды у личинок дрозофилы
происходит активация синтеза специфической
группы белков. Эта группа белков получила
название белков теплового шока (heat shock
proteins, Hsp). Позже было установлено, что синтез
Hsp индуцируется не только при повышении
температуры, но и при многих других неблагоприятных
воздействиях, таких как добавление к
клеткам органических растворителей,
тяжелых металлов, сильных оксидантов,
а также под влиянием некоторых гормонов
и ростовых факторов. В связи с этим некоторые
авторы называют Hsp стресс-белками.

Исследовательская группа во
главе с профессором биохимии
доктором Сабиной Росперт из Фрайбургского
университета Альберта-Людвига изучает,
как шапероны в конце туннеля рибосомы
влияют на судьбу вновь синтезированных
белков и как их функционирование координируется
во времени и пространстве. В 2005 году группа
профессора Росперт открыла шаперон ZRF1
в конце туннеля рибосом клеток человека.
ZRF1 демонстрирует структурные характеристики,
типичные только для белков, влияющих
на структуру хроматина.

 

 

 

 

 

 

 

 

Классификация шаперонов

В соответствии с молекулярной
массой все шапероны можно разделить
на 6 основных групп:

— высокомолекулярные, с молекулярной
массой от 100 до 110 кДа*;

— HsP-90 – с молекулярной массой
от 83 до 90 кДа;

— HsP -70 – с молекулярной массой
от 66 до 78 кДа;

— HsP -60;

— HsP -40;

— Низкомолекулярные шапероны
с молекулярной массой от 15 до 30 кДа.

Среди шаперонов различают:
конститутивные белки (высокий базальный
синтез которых не зависит от стрессовых
воздействий на клетки организма), и индуцибельные,
синтез которых в нормальных условиях
идёт слабо, но при стрессовых воздействиях
на клетку резко увеличивается. Индуцибельные
шапероны относятся к «белкам теплового
шока», быстрый синтез которых отмечают
практически во всех клетках, которые
подвергаются любым стрессовым воздействиям.
Название «белки теплового шока» возникло
в результате того, что впервые эти белки
были обнаружены в клетках, которые подвергались
воздействию высокой температуры.

* кДа — атомная единица массы
(обозначение а. е. м.), она же дальтон, внесистемная
единица массы, применяемая для масс молекул,
атомов, атомных ядер и элементарных частиц.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Свойства 

Шапероны 
были обнаружены в клетках млекопитающих 
и других организмов. Но что самое 
удивительное — оказалось, что они 
играют ключевую роль в функционировании
биологическ их систем всех уровней —
от отдельных клеток до организмов и даже
целых популяций. Эти вездесущие белки
являются самыми древними и консервативными
среди всех белков. Считается даже, что
они в какой-то степени руководят эволюционными
процессами. Образуясь в условиях стресса
(в частности при повышении температуры),
HSP помогают клеткам поддерживать в рабочем
состоянии все механизмы и избегать гибели.
Десять лет назад биологи обнаружили,
что у высших организмов, в том числе у
человека, HSP выполняют и другие важные
функции. Они участвуют в работе иммунной
системы, защищая организм от патогенов,
и в то же время предотвращают апоптоз
раковых клеток. Для того чтобы понять,
как можно использовать все многообразие
свойств шаперонов на практике, следует
разобраться в деталях их основной деятельности,
которая заключается в «контроле качества»
клеточных белков.

Такая деятельность
имеет две стороны:

  • предотвращение нежелательных белковых взаимодействий
  • поощрение полезных, что обеспечивает образование прочных связей как между самими белками, так и между белка ми и их партнерами.

 

Молекулярными
шаперонами сегодня называют группу
белков, которые взаимодействуют 
с развернутыми белками, стабилизируют 
их или способствуют ненативным белкам
принять нативную конформацию, однако
не входят в состав конечной функционирующей
структуры. Известно большое количество
различных шаперонов, но все они обладают
следующими свойствами:

  • Все молекулярные шапероны способны связываться с развернутыми или частично развернутыми полипептидами. Связывание шаперонов с гидрофобными участками развернутых белков эффективно предотвращает агрегацию белков в клетке.
  • Шапероны изменяют конформацию своих белковых субстратов. Одним из примеров этого является контролируемое разворачивание белка, которое, во-первых, создает связь между системой сворачивания белков в клетке и системой их деградации, а также может являться важным этапом сворачивания белка.
  • Все шапероны способны к контролируемому высвобождению субстратов. Согласно законам термодинамики, связывание шаперона с гидрофобными участками молекулы субстрата стабилизирует состояние шаперона, характеризующееся высоким сродством к субстрату. Поэтому для высвобождения субстрата необходима энергия, которая, как правило, получается путем гидролиза ATP или при взаимодействии шаперонов с другими компонентами системы сворачивания белков в клетке.

 

 

 

 

 

 

 

 

Функции белков – 
шаперонов

Шапероны разных семейств могут
функционировать в разных компартментах
клетки. Например, существуют различные
члены семейства Hsp70, работающие в цитоплазме,
митохондриях, хлоропластах и в эндоплазматическом
ретикулуме. Для функционирования всех
шаперонов требуется гидролиз ATP .

В эволюционном отношении Hsp
относятся к высококонсервативным белкам
и обнаруживаются во всех организмах от
бактерий до человека. Это свидетельствует
о том, что они выполняют фундаментальные
клеточные функции. Как цитопротекторные
свойства стресс — белков, так и их роль
в процессах нормальной жизнедеятельности
клетки во многом определяется тем, что
эти белки являются шаперонами. Шапероны
– это белки, которые облегчают формирование
вторичной и третичной структуры других
белков. Hsp также участвуют в процессах
репарации или элиминации неправильно
свернутых или денатурированных белков.
Согласно современной классификации выделяют
семь (в последнее время говорится даже
о восьми) типов sHsp, которые разделяют
либо по м.м., либо по выполняемым в клетке
функциям. Различают малые Hsp (small Hsp, sHsp),
а также высокомолекулярные Hsp110, 100, 90,
70, 60, 40. По характеру синтеза Hsp (подобно
NO-синтазе) подразделяются на коститутивные
и индуцибельные. Конститутивные Hsp синтезируются
в клетке постоянно, и для их активации
не требуется воздействия на клетку повреждающего
фактора, т.е. синтез их при стрессе не
увеличивается.

Синтез индуцибельных Hsp
начинается вскоре после воздействия
на клетку повреждающего агента. Данные,
полученные in vivo, свидетельстствуют о
том, что разделение Hsp на конститутивные
и индуцибельные в человеческом организме
достаточно условно, т.к. их синтез зависит
от специализации и функциональной активности
клеток. Каждый из охарактеризованных
Hsp выполняет специфические функции. Так,
белки семейства Hsp70 взаимодействуют с
вновь синтезируемой на рибосомах полипептидной
цепью, предотвращают преждевременное
неправильное сворачивание незрелой полипептидной
цепи и участвуют в транспорте белка к
определенным органеллам (митохондриям,
ЭПР и т.д.). Hsp100 очень близок Hsp70 и выполняет
защитную функцию, предохраняя организм
в условиях стресса. Hsp90 образуют сложный
комплекс с несколькими вспомогательными
белками — кошаперонами. Такой комплекс
взаимодействует с рецепторами стероидных
гормонов, обеспечивает их эффективное
связывание с рецепторами и последующий
перенос гормонрецепторного комплекса
в ядро. Помимо этого, Hsp90 участвуют в направленном
переносе нескольких типов протеинкиназ
к участкам их функционирования. Hsp60 могут
участвовать в фолдинге сложно устроенных
многодоменных белков (таких как актин
или тубулин), а также в АТФ — зависимом
исправлении ошибок в структуре частично
денатурированных белков. К последней
группе белков теплового шока относятся
sHsp, выполняющие множество разных функций
в клетке. Известно, что накопление белковых
агрегатов, являющееся результатом их
неправильного сворачивания, сопровождает
ряд заболеваний, таких как катаракта,
цирроз печени, некоторые виды миопатий,
губчатые энцефалопатии (болезнь Куру,
болезнь Крейцфельда-Якоба), нейродегенеративные
болезни и др. При болезни Паркинсона в
клетках обнаруживаются так называемые
тельца Леви, состоящие из sHsp и нейрофиламентов,
а цирроз печени сопровождается накоплением
телец Маллори, образованных кератиновыми
филаментами и sHsp. Зачастую агрегаты неправильно
свернутых белков образуют β-амилоидные
структуры, которые очень устойчивы к
протеолизу и не могут быть удалены из
клетки. Агрегаты белков, накапливающиеся
внутри клетки или в межклеточном пространстве,
невыясненным пока механизмом оказывают
повреждающее влияние и приводят к гибели
клеток. Детальное исследование взаимодействия
sHsp с белками промежуточных филаментов
может дать ключ к пониманию молекулярных
механизмов развития вышеперечисленных
заболеваний. Повышенный синтез sHsp наблюдается
не только в клетках, в которых происходит
накопление нерастворимых белковых агрегатов,
но и в клетках, подвергшихся воздействию
различных неблагоприятных факторов.Особое
внимание уделяется проблеме неспецифического
ответа клетки на повреждение, так как
предполагается, что между стресс-контролем
и контролем роста и дифференцировки клеток
существуют тесные взаимосвязи. Hsp участвуют
в формировании явления перекрестной
резистентности и феномена адаптационной
стабилизации структур, в восстановлении
нативной конформации белковых молекул,
в восстановлении активности ферментов
и, наконец, они взаимодействуют с антиоксидантной
системой и системой генерации оксида
азота. Система Hsp является одним из обязательных
звеньев неспецифического ответа клетки
на повреждение, и в организме человека
эта система находится под нейрогуморальным
контролем. Было доказано, что Hsp опосредуют
действие глюкоминералокортикоидов и
половых гормонов. В настоящее время кортикостероидам
придается решающее значение в координации
взаимодействия эндокринной и иммунной
систем при стрессе. Поэтому участие отдельных
Hsp в рецепции кортикостероидов и стероидогенезе
может предопределять связь между внутриклеточной
эндогенной системой защиты, к которой
относится система Hsp и центральным звеном
общего адаптационного синдрома при стрессе.•
Hsp, как шапероны, участвуют в синтезе гликопротеинов,
к которым относится тиреоглобулин, причем
механизмы стрессорной активации синтеза
белков теплового шока характеризуются
высокой тканевой специфичностью.

Шапероны, кроме своей основной
функции — укладки белков, осуществляют
и много других важных функций, связанных
с изменением конформации белков, а именно:

 

— Транспорт многих белков 
из одного компартмента в другой,
например, перенос субъеденицы фермента
Rubisco из цитоплазмы в хлоропласт происходит
при участии шаперона Hsp70, который находится
с ним в комплексе

— Участие в сигнальных 
путях. Например, присутствие Hsp70
необходимо для активации фосфатазы, 
которая путем дефосфорилирования
ингибирует протеинкиназу JNK , компонент
сигнала стресс-индуцированного апоптоза
, т.е. Hsp70 является частью антиапоптозного
сигнального пути

 

— Регуляция функций различных 
молекул. Например, стероидный рецептор
, находящийся в цитоплазме, связан с Hsp90; 
лиганд, попадающий в цитоплазму, присоединяется
к рецептору и вытесняет шаперон из комплекса.
После этого комплекс рецептор-лиганд
приобретает способность связываться
с ДНК, мигрирует в ядро и осуществляет
функцию транскрипционного фактора

 

Способность белка изменять
свою конформацию с «нормальной»
на «прионную», и в результате этого
участвовать в образовании упорядоченных
белковых агрегатов — ключевой момент
в прионообразовании. Исходя из этого,
можно предполагать влияние клеточных
шаперонов ( белков теплового шока ) на
кинетику данного процесса.

Шапероны представлены семействами,
состоящими из гомологичных по строению
и функциям белков, которые отличаются
по характеру экспрессии и присутствию
в разных компартментах клетки. Например,
Hsp70, Hsp60, Hsp90, Hsp100 и их кошапероны (белки,
помогающие шаперонам осуществлять свою
функцию более эффективно), а также гомологичные
им белки, например белок, связывающийся
с тяжелой цепью иммуноглобулинов ( BiP).
Шапероном является также ядерный нуклеоплазмин
, обеспечивающий сборку нуклеосом .

Основные шапероны млекопитающих
и дрожжей структурно и функционально
очень похожи между собой.

 

У дрожжей имеется шаперон,
который не встречается у млекопитающих,
— Hsp104 , относящийся к семейству Hsp100. Этот
шаперон особо важен для прионных белков
дрожжей, поскольку осуществляет расщепление
прионных полимеров и, в конце концов,
их частичную конверсию в мономерную форму.

 

 

 

 

 

 

 

 

Применение в 
медицине

Несмотря на многочисленные
исследования и несомненные успехи,
проблема молекулярных аспектов формирования
плацентарной недостаточности (ПН) остается
весьма актуальной. Появляются новые сведения
о роли дискретных изменений экспрессии
плацентарных белков различных категорий
в развитии функциональной недостаточности
плаценты. В последнее время большое внимание
в молекулярной биологии и медицине уделяется
белкам-шаперонам, обеспечивающим правильное
сворачивание (фолдинг) белка в клетке,
формирование и поддержание его нативной
структуры, рефолдинг в случае «неправильного»
фолдинга, транспорт синтезированного
белка к месту его функционирования, а
также предотвращение агрегации белков.
Нарушение функции шаперонов может приводить
к развитию патологических состояний,
поэтому изучение их динамики, состава
и роли в биохимических процессах клетки
важно для понимания молекулярных основ
патогенеза и методов диагностики осложненной
беременности.

Сворачивание белка из гетерогенного развернутого состояния, выявленное с помощью рассеяния рентгеновских лучей с временным разрешением.

Значимость

Белок претерпевает путь сворачивания, чтобы найти трехмерную структуру, которая выражает его биологическую функцию в живой клетке. В результате обширных теоретических исследований воронкообразный ландшафт свободной энергии был признан важной схемой для описания сворачивания белка, но было неясно, как динамическое поведение сворачивания белка связано с конформационной гетерогенностью.Здесь мы используем метод рассеяния рентгеновских лучей с временным разрешением в сочетании с систематическим структурным анализом для отслеживания сворачивания цитохрома c. Кинетика и структурные изменения, полученные из данных, показывают, что различные белковые конформации в развернутом состоянии принимают сложные пути сворачивания, приводя к растянутой экспоненциальной кинетике. Это исследование может предоставить структурное понимание фундаментальных принципов, управляющих сворачиванием белков.

Abstract

Одна из самых сложных задач биологической науки — понять, как белок сворачивается.В теоретических исследованиях гипотеза о воронкообразном ландшафте свободной энергии была признана важной схемой для объяснения сворачивания белка с точки зрения как внутренней энергии, так и конформационной гетерогенности белка. Однако, несмотря на многочисленные экспериментальные усилия, всестороннее изучение сворачивания белка в отношении его глобальных конформационных изменений в сочетании с гетерогенностью было труднодостижимым. Здесь мы исследуем окислительно-восстановительную динамику сворачивания цитохрома c (cyt-c) сердца лошади, индуцированного внешней инжекцией электронов, с помощью рассеяния рентгеновских лучей с временным разрешением.Систематический кинетический анализ раскрывает кинетическую модель его складывания с растянутым экспоненциальным поведением во время перехода к складчатому состоянию. С помощью метода оптимизации ансамбля в сочетании с моделированием молекулярной динамики, мы обнаружили, что во время сворачивания гетерогенно заселенный ансамбль развернутого состояния преобразуется в узко заселенный ансамбль свернутых конформаций. Эти наблюдения, полученные из кинетического и структурного анализа данных рассеяния рентгеновских лучей, показывают, что динамика сворачивания cyt-c сопровождает множество параллельных путей, связанных с гетерогенно заселенным ансамблем развернутых конформаций, что приводит к растянутой экспоненциальной кинетике при комнатной температуре.Это открытие предоставляет прямые доказательства с точки зрения микроскопических конформаций белков, что сворачивание cyt-c инициируется из очень гетерогенного развернутого состояния, проходит через все еще разнообразные промежуточные структуры и достигает структурной гомогенности, достигая свернутого состояния.

Белки должны сохранять уникальные трехмерные (3D) структуры, чтобы правильно выражать свои биологические функции в живых клетках. Линейная последовательность аминокислот в белке, высвобожденном из рибосомы, кодирует не только его нативную структуру, но и механизм сворачивания, с помощью которого эта структура достигается (1).Согласно аргументу Левинталя (2), ансамбль развернутых белков, гетерогенно населенных различными конформациями, вряд ли найдет свое естественное состояние посредством случайного поиска в обширном конформационном пространстве, а скорее восстановит свою природную форму посредством четко определенных путей складывания.

Было проведено множество теоретических исследований для описания сложной динамики складчатости с учетом ландшафтов свободной энергии (3⇓⇓⇓⇓⇓⇓ – 10). Среди различных концептуальных рамок было высказано предположение, что подобный воронке ландшафт свободной энергии со многими микросостояниями является схемой, подходящей для описания сворачивания белков (3, 4, 7, 10–12).На этой картинке ключевым фактором, определяющим динамику сворачивания белка, является естественное смещение. Это относится к преобладанию взаимодействий, стабилизирующих специфическую нативную конформацию, над неродными взаимодействиями, которые могут вести к топологически отличным ловушкам или фрустрированным конформациям, так называемым неправильно свернутым состояниям (3-5, 13). Другим фактором является конформационная гетерогенность в развернутом состоянии и промежуточных звеньях на пути, которые потенциально могут изменять кинетическое поведение при сворачивании белка из-за возможности широко распределенных путей.Таким образом, эта модель сворачивания имеет преимущество для объяснения конформационной гетерогенности и ее энергетики вдоль пути реакции сворачивания белка. Чтобы проверить сценарий воронкообразного ландшафта свободной энергии в сворачивании белков, были проведены многочисленные эксперименты с различными методами, такими как лазерно-индуцированный температурный скачок, быстрое перемешивание и спектроскопия одиночных молекул (14–1). ⇓⇓ – 24). Тем не менее, всестороннее понимание фолдинга белков, особенно в отношении его глобальных конформационных изменений в сочетании со структурной гетерогенностью, было труднодостижимым.Это просто из-за сложной природы любого белка. Наблюдение за эволюцией белковых молекул с таким внутренним разнообразием во времени в идеале может быть достигнуто с помощью вычислительных средств, таких как моделирование молекулярной динамики (МД). Однако в настоящее время надежное достижение цели — задача отнюдь не тривиальная. Отчасти это связано с тем, что моделирование в достаточно длительном масштабе времени по-прежнему является большим бременем. Возможно, что более важно, общедоступные параметры силового поля обычно оптимизированы для складчатых структур и могут не одинаково хорошо вести себя в течение всего процесса складывания из различных развернутых конфигураций.

Элюзивность хорошо иллюстрируется цитохромом c (cyt-c). Это небольшой металлопротеин, состоящий из 104 аминокислот и гемовой группы, ковалентно связанный с основной цепью белка. С момента пионерского исследования сворачивания cyt-c, инициированного диссоциацией монооксида углерода из гемовой группы (25), cyt-c был признан подходящей модельной системой для исследования сворачивания однодоменного белка с временным разрешением. . Было проведено множество экспериментальных исследований, которые отслеживали сворачивание cyt-c в широком диапазоне времени от субмикросекунд до поздних миллисекунд (18, 26–36).Эти эксперименты показали, что самосборка белковых скелетов, сопровождающаяся распадом расширенной конформации, начинается в субмиллисекундном режиме. Кроме того, максимальная скорость сворачивания белка была тщательно изучена с использованием оптического запуска для повторной укладки cyt-c, и эксперимент показал скорость диффузии (~ 35 мкс) -1 для локального контакта двух сайтов, разделенных ~ 50 остатки (37). Если мы предположим, что локальные контакты в раннем процессе сворачивания белка правильно отражают нативные взаимодействия, мы можем ожидать быстрого перехода в нативное состояние посредством механизма нуклеации-коллапса (38).Однако эксперименты с временным разрешением показали, что реальное время сворачивания в cyt-c занимает от нескольких десятков до сотен миллисекунд (18, 26–34), что намного медленнее, чем время диффузии основной цепи белка. сообщили в более раннем исследовании (37). Чтобы объяснить кинетическую разницу между быстрым внутрицепочечным движением основной цепи белка и относительно медленным сворачиванием, событие медленной фазы в миллисекундной области времени было неясно предположено либо как последовательные переходы через последовательные промежуточные соединения (26–29, 31–1). –33) или обходные пути через фрустрированные конформации на пути к нативной конформации (18, 38).Предполагается, что эта кинетическая сложность во время сворачивания cyt-c происходит из-за усложнения путей сворачивания, ассоциированных с лигированием, за счет нативно или нативно контактирующих остатков с гемовой группой. Используя связывание имидазола с гемовой группой или протонирование ошибочно связываемых остатков гистидина при низком pH с целью подавления образования неродных контактов, некоторые исследования показали, что действует механизм сворачивания с двумя состояниями (39, 40), тогда как отсутствие имидазола сопровождалось дополнительным обмен лиганда на метионин (26, 28, 29, 33).Между тем, другие исследования показали отклонение от кинетики двух состояний независимо от подавления неродной координации (41, 42). В конце концов, даже для этого довольно простого cyt-c с одним доменом нет единого мнения относительно интерпретации динамики сворачивания ввиду его конформационной гетерогенности.

Рассеяние рентгеновских лучей с временным разрешением (TRXSS) может служить эффективным способом получения исчерпывающего изображения, в основном благодаря превосходной структурной чувствительности от рассеяния рентгеновских лучей.Поскольку окислительно-восстановительное состояние гема, действующего как кофактор, связано со свободной энергией сворачивания, можно найти денатурирующее состояние, при котором белок полностью разворачивается в одном состоянии окисления, тогда как он полностью свернут в другом состоянии. В определенных денатурирующих условиях изменение окислительно-восстановительного состояния кофактора изменяет ландшафт свободной энергии, и это вызывает сильное естественное смещение в сторону свернутого состояния, как показано на рис. 1. В этой работе мы объединили TRXSS, а также известная как рентгеновская ликвидография с временным разрешением (43⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ – 51), с методом внешней инжекции электронов для исследования динамики окислительно-восстановительного сворачивания cyt-c.Мы сосредотачиваемся на изучении 1) того, как структурно неоднородная природа развернутого состояния изменяется в процессе складывания и 2) того, какой тип кинетического поведения сопровождается и связан с присущей ему гетерогенной природой. Анализ оптимизации ансамбля для данных рассеяния рентгеновских лучей, основанный на моделировании МД, показывает, что исходное окисленное состояние, которое вносит вклад в динамику сворачивания, имеет гетерогенно населенный ансамбль с различными развернутыми конформациями. Во время сворачивания это превращается в узко населенный ансамбль вокруг хорошо организованной складчатой ​​конформации через промежуточное состояние, которое все еще содержит конформационно гетерогенные характеристики.Удивительно, но медленная фаза сворачивания cyt-c, сопровождающая общее структурное изменение, проявляет экспоненциальное поведение при растяжении даже при комнатной температуре. Результаты анализа данных рассеяния рентгеновских лучей предоставляют прямые доказательства сворачивания белков из гетерогенно заселенного развернутого состояния посредством множественных кинетических путей и понимание фундаментальных принципов, управляющих сворачиванием белков с учетом глобальных конформаций белков и связанных с ними кинетических поведений.

Фиг.1.

Ландшафты свободной энергии, индуцированные внешней инжекцией электронов. Обычные поверхности свободной энергии для двух различных условий в зависимости от репрезентативных координат реакции ( q 1 и q 2 ). Координаты реакции соответствуют локальным структурным изменениям в белке, таким как колебательные моды конкретных остатков или расстояния между остатками. Поверхность свободной энергии может быть изменена путем изменения белковой среды, указанного желтой стрелкой, например степени окисления кофактора и состояния растворителя.Отсюда бассейн развернутого состояния на поверхности свободной энергии ( Bottom ) изменяется как склон на реконструированной энергетической поверхности ( Top ). Изменение энергетики активирует пути самопроизвольного сворачивания, обозначенные пурпурной стрелкой, вдоль координат реакции. Как показано серой пунктирной стрелкой, в исходном состоянии этот путь заблокирован.

Результаты

Структурный анализ кривых рассеяния рентгеновских лучей.

Перед анализом данных TRXSS мы сначала исследуем данные статического рассеяния рентгеновских лучей как для состояния трехвалентного железа (окисленное), так и для состояния двухвалентного железа (восстановленное), чтобы подтвердить, что cyt-c трехвалентного железа разворачивается в условиях денатурации 3.5 M GdnHCl и исследовать неоднородность развернутого состояния. Чтобы преодолеть ограничение принятия единственной конформации, которая обычно используется при анализе структуры хорошо структурированного белка (45–47, 52), мы применили метод ансамблевой оптимизации (EOM) в сочетании с МД моделирования (53–55). . Вкратце, белковые структуры, описывающие конформационный ландшафт, сначала генерируются из снимков МД-моделирования и используются для расчета теоретических кривых рассеяния рентгеновских лучей, соответствующих отдельным конформационным состояниям.В этом анализе предполагается, что экспериментальная кривая рассеяния рентгеновских лучей возникает из ансамбля, включающего определенное количество сосуществующих конформационных состояний. Это хорошо подходит для описания структурных особенностей потенциально гибкой системы (53, 55). Схема этого анализа и его детали описаны в Приложении SI (см. SI Приложение , Рис. S1 и Примечание 1, для получения дополнительной информации). Используя генетический алгоритм (56), окончательно выбирается ансамбль, который лучше всего соответствует экспериментальным данным для извлечения оптимальных структурных параметров, таких как радиус инерции (R g ) и трехмерная конформация белка.Чтобы гарантировать достаточно широкую конформационную выборку в моделировании МД, мы использовали три различных времени моделирования: 100 нс, 500 нс и 1 мкс и проверили зависимость окончательных результатов EOM от времени. В частности, мы повторили весь анализ EOM с использованием пулов, созданных из шести независимых траекторий MD для каждого времени моделирования.

Рис. 2 A C показывает распределения R g , полученные из EOM-анализа для статических кривых рассеяния рентгеновских лучей окисленного и восстановленного состояний, основанные на разном времени моделирования.Примитивные распределения R g непосредственно из моделирования MD до EOM также показаны на рис. 2 ( SI, приложение , рис. S2). Несмотря на то, что максимальные значения R g для разных пулов довольно сильно различаются, все пулы охватывают значения R g (24–29 Å) развернутого cyt-c, о которых сообщалось в предыдущих экспериментах (30, 57). Результаты анализа EOM показывают, что хотя распределения R g в окисленном состоянии, оптимизированные с помощью шести независимых МД-моделирования, совершенно не согласуются друг с другом при времени моделирования 100 нс, они в конечном итоге хорошо перекрываются после 500 нс.Это просто демонстрирует, что конформационное распределение с учетом R g из МД моделирования сходится с увеличением времени моделирования ( SI Приложение , рис. S2). Даже несмотря на то, что есть некоторые незначительные отличия в оптимизированных ансамблях от МД моделирования длительностью 1 мкс, очевидно, что различные развернутые конформации гетерогенно заселены в окисленном состоянии под 3,5 М GdnHCl. Среднее значение R g из EOM на основе моделирования длительностью 1 мкс изменяется с ∼26 Å для окисленного состояния до ∼13 Å для восстановленного состояния ( SI Приложение , рис.S3). Основываясь на характерных конформациях белков, определенных с помощью EOM-анализа ( SI Приложение , рис. S4 и S5), мы наблюдаем, что для описания ансамбля окисленных cyt-c потребовались по крайней мере четыре развернутые конформации как с протяженными, так и с запутанными структурами. Согласно исследованию малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) окисленного cyt-c при различных концентрациях GdnHCl (57), равновесие между нативным, частично развернутым и полностью развернутым состояниями существует в денатурирующих условиях и при 3.5 M GdnHCl молярное соотношение трех составляет ∼0: 4: 6. Кроме того, на основании существования дополнительного сингулярного вектора из анализа разложения по сингулярным значениям (SVD) было смутно предполагалось, что может существовать еще одно денатурированное состояние. Наша модель окисленного cyt-c, определенная из EOM по крайней мере с четырьмя репрезентативными состояниями, имеет более высокую гетерогенность, чем было предложено в этом предыдущем исследовании SAXS (57). Для ансамбля восстановленного cyt-c действительно достаточно было одной свернутой конформации. Отметим, что теоретическая кривая рассеяния от одной индивидуальной репрезентативной структуры в ансамбле окисленного cyt-c не может воспроизвести экспериментальные данные ( SI Приложение , рис.S4). Этот аспект подразумевает присущую конформационной гетерогенности окисленного cyt-c под действием 3,5 М GdnHCl.

Рис. 2.

Структурный анализ кривых рассеяния рентгеновских лучей на основе EOM. ( A C ) Распределение R g , определенное из анализа EOM для статических кривых рассеяния рентгеновских лучей окисленного и восстановленного состояний на основе времени развертки MD моделирования ( A) 100 нс, ( B ) 500 нс и ( C ) 1 мкс. Для каждого времени моделирования было выбрано шесть независимых траекторий, начиная с одной общей структуры.На каждой панели показаны распределения R g окончательно оптимизированных ансамблей (квадраты), а также покрытие конформационного пространства белковыми структурами-кандидатами из моделирования MD (пунктирные линии). Теоретические кривые рассеяния конечных ансамблей хорошо соответствуют экспериментальным кривым в пределах погрешностей ( SI Приложение , рис. S4). По мере увеличения времени моделирования для выборки структур-кандидатов несоответствие между шестью развернутыми распределениями, оптимизированными с помощью шести траекторий, становится незаметным.( C , Bottom ) Репрезентативные структуры сложенного и развернутого состояния с этими относительными популяциями. Ясно, что различные развернутые конформации неоднородно заселяются в оптимизированном развернутом ансамбле (незакрашенные квадраты), а единичная конформация однородно заселяется в оптимизированном свернутом ансамбле (закрашенные квадраты).

TRXSS.

Схема реакции сворачивания cyt-c сердца лошади, запускаемого внешним переносом электрона, показана на рис.3 А . При возбуждении на длине волны 355 нм никотинамидадениндинуклеотид (НАДН), действующий как внешний источник электронов, генерируется реактивная форма с сольватированным электроном, которая быстро восстанавливает окисленный cyt-c с развернутой конформацией белка (26⇓⇓-29, 31, 33, 58). На основании кривых равновесного развертывания для окисленного и восстановленного cyt-c (рис. 3 B и SI Приложение , рис. S6 и S7), при нейтральном pH концентрация гидрохлорида гуанидина (GdnHCl) находится в диапазоне от 2.От 8 до 4,5 M индуцирует полное свертывание восстановленного cyt-c, тогда как те же условия переводят окисленную форму в развернутое состояние с долей более 90%. Это хорошо согласуется с результатами более ранних исследований (29, 33–35). Следовательно, концентрация 3,5 M GdnHCl является подходящим условием для инициирования спонтанного сворачивания развернутого cyt-c через изменение окислительно-восстановительного состояния кофактора. Используя окисленный cyt-c, растворенный в фосфатном буфере с 20 мМ NADH и 3.5 M GdnHCl, мы провели эксперименты TRXSS, чтобы исследовать динамику сворачивания, запускаемую внешним переносом электрона.

Рис. 3.

Схема динамики сворачивания cyt-c, индуцированного внешней инжекцией электронов. ( A ) Развернутый cyt-c с окисленной гемовой группой претерпевает динамику сворачивания, запускаемую инжекцией электронов из NADH, действующего как внешний донор электронов для гемовой группы в cyt-c. ( B ) Кривые развертывания равновесия для окисленного (Fe 3+ ) и восстановленного (Fe 2+ ) cyt-c в зависимости от молярной концентрации GdnHCl.Эти кривые были восстановлены по данным спектроскопии кругового дихроизма. Эксперимент TRXSS проводился с использованием фотоиндуцированного переноса электрона при концентрации 3,5 М GdnHCl.

Кривые разностного рассеяния с временным разрешением, q ∆S ( q , t ), были измерены в широком диапазоне времени от 31,6 мкс до 316 мс ( SI Приложение , рис. S8). Разностные кривые рассеяния показывают не только значительную амплитуду в малоугловой области ( q <0.4 Å −1 ), что связано с глобальным конформационным изменением, но также и осцилляторными особенностями в широкоугольной области (0,4 Å −1 < q <2,2 Å −1 ), которые могут быть объясняется тонкими структурными изменениями, такими как перестройка вторичной структуры (45, 47, 50) или термический отклик растворителя с релаксацией фотовозбужденной молекулы (45, 51). Кроме того, из предыдущих исследований (27, 58) известно, что фотовозбужденный НАДН образует фотопродукты, такие как (НАД) 2 , а также возвращается в свое основное состояние.Чтобы отличить вклад нагревания растворителя и образования (NAD) 2 от данных TRXSS, мы провели дополнительный эксперимент с использованием буферного раствора с тем же составом, но без белка (подробности см. В приложении SI, приложение , примечание 2). . В принципе, образование (NAD) 2 и сопровождающее его увеличение электронной плотности может изменить сигнал рассеяния в малоугловой области ( q <0,4 Å -1 ). Разностный сигнал рассеяния безбелкового буферного раствора в малоугловой области невелик и без особенностей, тогда как сигнал в широкоугольной области (0.8 Å −1 < q <2,2 Å −1 ) является доминирующим ( SI Приложение , рис. S8 B ). Из сравнения разностных кривых рассеяния двух растворов ( SI Приложение , рис. S9) мы можем убедиться, что влияние образования фотопродукта на всю область q незначительно и что только реакция на растворитель Нагревание заметно в широкоугольной области. Поэтому, чтобы извлечь фотоиндуцированный сигнал чистого белка из данных рентгеновского излучения с временным разрешением, вклад нагревания растворителя был удален путем вычитания сигнала, который был получен в отдельном эксперименте с раствором, не содержащим белка, в соответствии с установленными протоколами ( 45, 47, 51).

Кинетика сворачивания белков.

Рис. 4 A показывает кривые разностного рассеяния рентгеновских лучей с временным разрешением, q ∆S ( q , t ), которые являются экспериментальными данными без нагрева. Количественный кинетический анализ был проведен с использованием SVD для определения констант скорости, которые описывают зависящее от времени изменение данных без нагрева (45–47, 59). SVD разложил исходные данные на независимые от времени компоненты (левые сингулярные векторы), связанную с ними временную зависимость (правые сингулярные векторы [RSV]) и относительный вклад каждого компонента (сингулярные значения).На основе этого анализа ( SI, приложение , рис. S10) мы идентифицировали два значимых сингулярных вектора и соответствующие коэффициенты автокорреляции, предполагая, что в измеренном временном диапазоне формируются два вида, различимых по рассеянию рентгеновских лучей (рис. 4 B ). ). Простейшая кинетика с двумя состояниями, включающая два вида, будет одноэкспоненциальным преобразованием первого вида в другой, и глобальное соответствие этому предположению не дало приемлемого соответствия (случай с β = 1 на рис.4 С ). Это отклонение указывает на существование параллельных путей, соединяющих два вида. Мы рассмотрели двух кандидатов для двухуровневой кинетики с параллельными путями: 1) бифуркационная кинетика от первого вида ко второму с двумя экспонентами, которую можно рассматривать как простейшую параллельную кинетику, и 2) растянутая экспоненциальная кинетика с e− (t / τ) β, как крайний случай с параллельными путями, в котором значение β обозначает степень суперпозиции многих экспоненциальных распадов (60).Как биэкспонента с масштабами времени 16,4 (± 5,1) мс и 193 (± 34) мс, так и растянутая экспонента с τ = 185 (± 75) мс и β = 0,70 (± 0,08) демонстрируют хорошее согласие с RSV ( SI Приложение ). , Рис. S10 B ). Отметим, что бифуркационная кинетика отличается от последовательной последовательной кинетики, предложенной в более ранних оптических спектроскопических исследованиях (26, 28, 29), где для объяснения двух постоянных времени требовалось три вида. Поскольку анализ SVD предполагает, что только два вида образовались в измеряемой временной области, мы исключили возможность такой последовательной кинетики ( SI Приложение , рис.S11).

Рис. 4. Данные TRXSS

для динамики сворачивания cyt-c. ( A ) Экспериментальная (черная) и теоретическая (красная) разностные кривые рассеяния. ( B ) SADS, извлеченные из глобального кинетического анализа. Второй SADS (красный) сравнивается с разницей для статических кривых рассеяния рентгеновских лучей восстановленной и окисленной форм (серый). Высокое сходство между вторым SADS и статической разницей, q ∆S static , подтверждает, что наблюдаемая динамика связана со сворачиванием белка.( C ) Зависимое от времени изменение популяции промежуточных продуктов (точки) сравнивается с теоретической динамикой популяции (линии), основанной на растянутой экспоненциальной кинетике. Значения, показанные в правой части графика, представляют значения β в растянутой экспоненте, e- (t / τ) β, в диапазоне от 0,15 до 1,0. Экспериментальная динамика популяции хорошо согласуется с растянутой экспоненциальной кинетикой с постоянной времени (τ), равной 185 (± 75) мс, и значением β, равным 0,70 (± 0,08).

На основе моделей растянутой экспоненциальной и раздвоенной кинетики мы выполнили анализ главных компонент с использованием постоянных времени, определенных на основе SVD-анализа.Подробности этого кинетического анализа описаны в Приложении SI (см. SI Приложение , Примечание 3, для получения дополнительной информации). Из этого анализа мы извлекли кривые разностного рассеяния, связанные с видами (SADS), и зависящие от времени вклады SADS. Те, которые определены из растянутой экспоненциальной кинетики, показаны на рис. 4. Каждый SADS содержит информацию о структуре белкового промежуточного соединения. Первый SADS, сформированный в микросекундном режиме, имеет монотонную особенность с небольшой отрицательной амплитудой около 0.1 Å −1 на разностной кривой рассеяния, тогда как вторая SADS, сформированная в режиме поздней миллисекунды, имеет заметную осциллирующую особенность в пространстве q от 0,05 до 0,8 Å −1 . Несмотря на то, что первый SADS имеет гораздо меньший вклад, чем второй, исключение первого компонента в кинетике складывания приводит к худшему согласию между экспериментальными и теоретическими данными ( SI Приложение , рис. S12), указывая на то, что сворачивание cyt-c должно включать первый вид.Небольшое уменьшение интенсивности рассеяния в малоугловой области первого SADS означает, что белковая конформация первого интермедиата немного более развернута по сравнению с конформацией исходного состояния. Чтобы установить причину конформационного изменения при переходе от первого SADS ко второму, мы сравнили разницу статических кривых рассеяния восстановленной и окисленной форм [∆S static ( q ) = S восстановленный ( q ) — S окисленный ( q )] с соответствующим образом масштабированным вторым SADS, как показано на рис.4 В . Хорошее соответствие между ними свидетельствует об образовании складчатого состояния при переходе от первого вида ко второму. Когда кривые рассеяния были восстановлены из линейной комбинации SADS, подчиняющихся растянутой экспоненциальной кинетике, они показали отличное совпадение с экспериментальными кривыми (рис. 4 A ), подтверждая, что сворачивание cyt-c точно следует неэкспоненциальной кинетике. Фактически, почти одинаковые SADS также получаются из модели раздвоенной кинетики, потому что оба случая неотличимы на трассе ( SI Приложение , рис.S11). Следовательно, выбор между растянутой экспонентой и бифуркационной кинетикой при объяснении динамики сворачивания cyt-c не может быть сделан исключительно на основании кинетического следа. По этой причине мы реализовали дополнительный анализ, основанный на методе максимальной энтропии (MEM), посредством которого зависящий от времени сигнал можно объяснить распределением постоянных времени (61). Из этого анализа было извлечено оптимальное распределение логарифмических постоянных времени из экспериментальных данных (см. SI Приложение , примечание 3 и рис.S13, подробнее). Широкое распределение логарифмических постоянных времени, охватывающих от раннего до позднего миллисекундного режима, подтверждает, что экспериментальный след, вероятно, следует за растянутой экспоненциальной кинетикой, а не за раздвоенной. Подробные сведения о кинетике сворачивания в этом отношении приведены в Discussion .

Обсуждение

Кинетический анализ показывает, что данные TRXSS можно объяснить следующей схемой динамики сворачивания, вызванной изменением окислительно-восстановительного состояния кофактора: U (Fe3 +) → <31.6μsU '(Fe2 +) → F (Fe2 +). Здесь U - начальное развернутое состояние до фотовосстановления cyt-c, а U ′ и F - промежуточные и конечные фотопродукты, участвующие в динамике сворачивания, соответственно. Результаты анализа EOM для статической кривой рассеяния окисленного cyt-c, показанной на фиг. 2, предполагают, что исходное состояние U с окисленной формой железосодержащей гемовой группы имеет конформационную гетерогенность, включая различные развернутые структуры. Промежуточное звено U 'образуется в пределах 31.6 мкс, что является первой задержкой в ​​нашем эксперименте. Принимая во внимание время ~ 33 мкс, необходимое для восстановления окисленного cyt-c сольватированным электроном и радикалом NAD, образующимся при фотовозбуждении NADH (27, 58), состояние U ', вероятно, имеет восстановленную форму железосодержащей гемовой группы. Кроме того, уменьшение амплитуды рассеяния в малоугловой области первого SADS свидетельствует о небольшом увеличении его объема и размеров по сравнению с U-состоянием. Из сравнения второго SADS и разницы между статическими кривыми рассеяния рентгеновских лучей окисленного и восстановленного cyt-c, мы обнаруживаем, что конечное состояние F имеет полностью свернутую конформацию с хорошо организованными вторичными структурами и восстановленным гемом.

Как уже упоминалось, на основе глобального кинетического анализа данных TRXSS, главное событие сворачивания при переходе от U ‘к F можно объяснить как растянутой экспоненциальной, так и раздвоенной кинетической моделями. Это связано с типичной проблемой неопределенности экспериментальных данных с ограниченным отношением сигнал / шум. В то время как результаты MEM отдают предпочтение растянутой экспоненциальной кинетике по сравнению с раздвоенной, желательно иметь дополнительные логические аргументы, помимо качества подгонки в кинетическом анализе.Чтобы решить эту проблему, мы рассматриваем структурную информацию, доступную из анализа EOM для данных статического рассеяния. Ансамбль окисленных cyt-c, связанных с исходным состоянием U, демонстрирует заметную структурную неоднородность, включая по крайней мере четыре репрезентативных конформации как с протяженными, так и с запутанными структурами (Рис. 2 и SI Приложение , Рис. S4). Если мы применим растянутую экспоненциальную кинетику, различные развернутые конформации со значениями R g от 20 до 30 Å в состоянии U индивидуально претерпевают восстановление до структурно неоднородного состояния U ‘, которое кинетически выражается как один репрезентативный вид.После этого различные развернутые конформации в состоянии U ‘, вероятно, будут принимать разные пути сворачивания с разным временем сворачивания в направлении гомогенного свернутого состояния F с R g 13,2 Å. Суперпозиция множества параллельных путей с разными временными шкалами совместима с растянутым экспоненциальным поведением. Когда мы предполагаем бифуркационную кинетику, два параллельных пути могут быть отнесены к событию сворачивания из гетерогенно заселенного состояния U ‘в сложенное состояние. Например, некоторая часть разложенных структур может быстро складываться без перехода в неправильно сложенное состояние, а другая оставшаяся часть может продвигаться по пути неправильного свертывания к исходному состоянию.А именно, две разные шкалы времени могут возникать из-за наличия или отсутствия неправильно свернутого состояния в пути сворачивания. Хотя эта гипотетическая ситуация может поддерживать бифуркационную кинетику, неясно, как чрезвычайно гетерогенные конформации в U ‘состоянии будут благоприятствовать только двум путям к конечному свернутому состоянию. Будет более убедительно, что гетерогенные развернутые конформации принимают множественные пути, которые потенциально проходят через различные неправильно свернутые конформации на поверхности свободной энергии.Суперпозиция таких различных путей сворачивания фактически сливается с единой растянутой экспоненциальной кинетикой, и поэтому мы предполагаем, что растянутая экспонента будет операционной кинетикой сворачивания cyt-c.

Предыдущие исследования сворачивания cyt-c подтвердили присутствие кинетических фаз в микросекундном временном режиме, называемом фазой всплеска ( SI Приложение , Fig. S14). Используя спектроскопию кругового дихроизма с временным разрешением (TRCD) на фолдинге cyt-c с переносом электронов, Клигер и его коллеги сообщили о постоянной времени 5 мкс в фазе всплеска и приписали это быстрому образованию частичных вторичных структур, связанных с коллапсом протяженных случайная катушка (33).Это самое раннее событие аналогично наблюдалось при использовании оптической вращательной дисперсии с временным разрешением (TRORD), где процесс быстрой фазы был приписан ошибочному связыванию His33 (26, 28, 29). Эти исследования показали, что промежуточное звено ранней фазы, генерируемое внезапным коллапсом случайной катушки, преобразуется непосредственно в естественное состояние во время медленной фазы за сотни миллисекунд. С точки зрения временных масштабов, состояние U ‘, наблюдаемое в нашем исследовании, можно сравнить с ошибочным состоянием, сопровождающим частичное формирование вторичной структуры, наблюдаемое TRCD и TRORD (26, 28, 29, 33).Однако в первом SADS наблюдается уменьшение амплитуды рассеяния в малоугловой области, что означает небольшое увеличение объема и размера белка по сравнению с U-состоянием. Другими словами, это слегка расширенное состояние U ‘, возникающее до определяющего скорость сворачивания, структурно отличается от состояния расплавленной глобулы, которое обладает более частично свернутыми конформациями, образованными внезапным схлопыванием случайного клубка (30, 41, 62). Эта разница, вероятно, является следствием принятия сильных денатурирующих условий с 3.5 М GdnHCl. Согласно более раннему исследованию флуоресценции (41), относительная амплитуда кинетического следа флуоресценции на ранней фазе значительно уменьшается с увеличением концентрации GdnHCl. Это естественно, поскольку GdnHCl имеет тенденцию к дестабилизации компактных состояний, которые могут образовываться на начальной стадии сворачивания (30, 57). Кроме того, дестабилизация более заряженного гема после окисления в белковой среде с низкой диэлектрической проницаемостью может быть смягчена при высоких концентрациях GdnHCl (63), а восстановление гема может энергетически не отдавать предпочтение движению белка на ранней фазе, необходимому для формирования состояния расплавленной глобулы. например, сокращение основной цепи.

Кинетический анализ данных TRXSS показывает, что состояние U ‘претерпевает переход в конечное состояние с постоянной времени 185 мс. В исследовании TRCD с многоэкспоненциальной подгонкой кинетика в этом временном режиме показала затухание с постоянной времени 110 мс, что было приписано смещению ошибочно связанных остатков по кофактору гема (33), хотя погрешность довольно велика из-за ограниченное отношение сигнал / шум в данных TRCD. С помощью спектроскопии TRORD было обнаружено единичное затухание в медленной фазе длительностью 160 мс при несколько более низкой концентрации GdnHCl, равной 3.3 M и был приписан образованию нативной структуры в процессе лигирования между Met-80 и гемом (29). Аналогичное время сворачивания, равное 185 мс, было зарегистрировано для cyt-c сердца тунца, содержащего остаток триптофана в месте, занимаемом His33 в cyt-c сердца лошади (28). С помощью спектроскопических экспериментов по нестационарному поглощению было показано, что медленное фазовое сворачивание восстановленного cyt-c следует за одним экспоненциальным распадом со временем жизни в сотни миллисекунд, которое совпадает с изменением флуоресценции триптофана (31, 32).Наша постоянная времени 185 мс в растянутой экспоненциальной кинетике, идентифицированной TRXSS, относительно хорошо совпадает с таковой из предыдущих исследований ( SI Приложение , рис. S14). Однако отметим, что гетерогенный переход U ′ → F, выраженный как растянутая экспонента, резко контрастирует с нормальным экспоненциальным поведением, интерпретируемым как последовательные переходы промежуточных продуктов с конформационной однородностью в более ранних исследованиях (26, 28, 29, 31, 32). ). С другой стороны, исследование перемешивания при остановленном потоке восстановленного cyt-c в сочетании со спектроскопическими измерениями выявило две фазы в кинетике рефолдинга, когда концентрация GdnHCl была меньше, чем ~ 1.5 M, хотя при 3,5 M GdnHCl, той же концентрации, которая использовалась в нашей работе, наблюдалась только одна фаза (42). Две фазы могут быть объяснены либо конформационной гетерогенностью развернутого cyt-c, либо кинетическим разделением гомогенного развернутого состояния (64). Наше наблюдение глобальных конформационных изменений поддерживает первый сценарий даже при условии высокой концентрации GdnHCl. Это различие возможно, поскольку TRXSS непосредственно определяет общую структуру, в отличие от типичных спектроскопических инструментов.

Действительно, гетерогенный переход к окончательному свернутому состоянию при медленном фазовом сворачивании cyt-c может представлять экспериментальное воплощение воронкообразного ландшафта свободной энергии при сворачивании белка, который предполагает множественные переходы из разных микросостояний в развернутом состоянии в уникальный глобальный минимум свернутого состояния (12). Вероятный сценарий, согласующийся с нашим наблюдением, состоит в том, что различные развернутые структуры в начальном окисленном состоянии принимают конформационно-специфические пути и останавливаются промежуточными конфигурациями на маршруте, расположенными в разных местах ландшафта свободной энергии.В частности, на ранней стадии сворачивания некоторые фракции развернутых белковых структур будут формировать нативные взаимодействия и приводиться к правильно свернутому состоянию, тогда как другие будут сталкиваться с местами ловушек в локальных минимумах на энергетическом ландшафте сворачивания. Различия в путях сворачивания, происходящие из различий в развернутых конформациях, вероятно, приведут к разному времени сворачивания для каждого пути сворачивания. Растянутая экспоненциальная кинетика, наблюдаемая с cyt-c в медленной фазе, может быть интерпретирована как сумма многих отдельных экспонент, и этот аспект поддерживает кинетическое разделение неоднородного развернутого состояния при складывании, которое может возникать из-за неровных особенностей вокруг высокого уровня. энергетическая область складчатого ландшафта свободной энергии.Наш сценарий динамики сворачивания cyt-c также может быть связан с сильно растянутым экспоненциальным поведением на ранней фазе сворачивания, о чем сообщалось в низкотемпературном исследовании с остановленным потоком рефолдинга cyt-c трехвалентного железа (18). Как отмечалось ранее, это поведение будет соответствовать множеству параллельных путей, инициируемых как можно большим количеством различных развернутых конформаций. Таким образом, наши результаты предоставляют четкие доказательства гетерогенного сворачивания cyt-c с участием структурно различных множественных развернутых конформаций и контрастируют с точкой зрения с однонаправленными последовательными путями из однородно определенного развернутого состояния, обсуждавшимися в предыдущих исследованиях (26-29, 31 , 33, 34).В предыдущем исследовании SAXS сообщалось, что высокая концентрация GdnHCl увеличивала популяцию полностью развернутого состояния с высоким содержанием случайных спиралей (57), а другое спектроскопическое исследование показало, что по мере увеличения концентрации GdnHCl происходили события сворачивания в масштабе сотен миллисекунды замедляются при комнатной температуре (31). Если эти результаты применить к нашему наблюдению, мы ожидаем, что время сворачивания может довольно чувствительно изменяться с концентрацией GdnHCl, поскольку это будет влиять на соотношение заселенностей микроскопических развернутых состояний и их термодинамическую энергетику.Например, при более высокой концентрации GdnHCl популяция развернутой конформации с более высокими значениями R g и расширенной структурой будет увеличиваться, что может привести к увеличению времени складывания, коррелированному с развернутой конформацией cyt-c.

Отметим, что шкала времени цепной диффузии в cyt-c составляет несколько десятков микросекунд (65). Принимая во внимание эту относительно быструю диффузию основной цепи, медленное взаимное преобразование между многими конформерами в состоянии U ‘может показаться несовместимым.Это разрешается, когда они не могут быть взаимно преобразованы одной цепной диффузией. Есть по крайней мере два фактора, которые способствуют увеличению барьеров между развернутыми конформерами в состоянии U ‘: 1) неправильное лигирование гем-остатков и 2) неродные конфигурации остатков пролина. В случае неправильно лигированных конформеров взаимное преобразование в сторону нативного лигирования требует замещения ошибочно связанных остатков, что маловероятно при цепной диффузии. Кроме того, мы не можем исключить наличие неродных конфигураций остатков пролина в развернутом cyt-c.Согласно предыдущим исследованиям (42, 66), время трансцис-изомеризации пролина намного больше, чем время цепной диффузии. В целом, мы предполагаем, что происхождение гетерогенной кинетики от U ‘к F является гетерогенностью развернутых конформеров в U’ состоянии из-за неправильного лигирования взаимодействий остаток-гем и изомеризации пролина, которая не может быть преобразована между собой только посредством быстрой цепной диффузии. Этот аспект в конечном итоге приводит к широкому распределению времени складывания.

Мы также отмечаем, что мы использовали моделирование MD для генерации ложных структур для процесса EOM на основе выбора с помощью генетического алгоритма.Таким образом, насколько хорошо структурный ансамбль из MD-траекторий представляет сложенное и развернутое состояние, не имеет значения, пока траектории могут покрывать термически доступное конфигурационное пространство в пределах доступного времени моделирования. Конечно, было бы идеально, если бы моделируемый ансамбль мог напрямую согласовывать данные рассеяния без какой-либо корректировки ансамбля через EOM. Фактически, когда мы сравниваем распределение R g из любого пула структур, представленного на рис.2 A C против распределения после его обработки EOM для развернутого состояния, мы обнаруживаем, что данные пула структур отображают более высокие вероятности на меньшей стороне R g . А именно, MD-структуры обычно более сжаты, чем фактические экспериментальные структуры, о чем также сообщалось в теоретических исследованиях неупорядоченных белков (67). Таким образом, мы можем сделать вывод, что принятые параметры силового поля нефизически предпочитают более компактные структуры даже при высокой температуре (800 K), используемой для наших расчетов.Вероятно, что воспроизведение свернутых символов состояния было более важным при оптимизации силового поля. Улучшение его таким образом, чтобы лучше воспроизводились признаки менее структурированных состояний, будет важно для изучения белков в целом, особенно с внутренне неупорядоченными белками. Наш подход может предоставить полезный инструмент для достижения этой цели, поскольку он создает прямую цель для сравнительного анализа. А именно, сравнивая теоретические данные рассеяния, полученные на основе моделируемого ансамбля, с фактически измеренными экспериментальными данными, можно оценить точность принятой модели силового поля как для свернутого, так и для развернутого состояния.Хотя наша схема анализа EOM с моделированием MD успешно извлекла структурную информацию о гетерогенном ансамбле развернутого cyt-c, остается место для дальнейшего улучшения того, как генерировать конформации белка-кандидата. Например, анализ молекулярного форм-фактора (MFF) может быть альтернативным способом для денатурированных и внутренне неупорядоченных белков, поскольку данные SAXS могут быть проанализированы с помощью заранее определенных безразмерных MFF без каких-либо дополнительных моделей MD (68).

Выводы

Таким образом, используя TRXSS, мы смогли установить динамику сворачивания cyt-c с неэкспоненциальной кинетикой при переходе между двумя состояниями (U ‘и F).Комбинация результатов, полученных из кинетического и структурного анализа данных рассеяния рентгеновских лучей, показала, что различные конформации белка в развернутом состоянии принимают множественные пути релаксации к свернутой конформации, что приводит к растянутому экспоненциальному поведению. Рис. 5 суммирует подробную схему динамики спонтанного сворачивания cyt-c, особенно выделяя множественные пути релаксации, связанные с конформационной гетерогенностью в развернутом состоянии.Это наблюдение является прямым доказательством сворачивания белка из гетерогенных развернутых состояний с учетом микроскопических конформаций белка. Популяции, которые могут образовывать неродные лигирования на гемовой группе, вероятно, будут индуцировать различные неправильно свернутые структуры, расположенные в локальных минимумах свободной энергии сворачивания. Быстрый выход из этих минимумов приведет к быстрой кинетике сворачивания, в то время как попадание в ловушку в глубоких минимумах энергии потребует гораздо больше времени и обходных путей к естественному состоянию. Существование всех этих сложных путей, связанных с различными состояниями лигирования гема и родственных конформеров, несомненно, добавит уровень гетерогенности в его динамику сворачивания и разворачивания.Когда такие усложняющие факторы сочетаются вместе, они будут способствовать тому, что кинетика будет казаться разнообразной с растянутым экспоненциальным поведением cyt-c. Таким образом, насколько можно обобщить наш вывод относительно разнообразия путей сворачивания, следует рассматривать как открытый вопрос, и ответ на этот вопрос в будущем определенно будет интересным и важным. Мы считаем, что наш подход, безусловно, может способствовать решению этой проблемы путем дальнейшего изучения других систем складывания. Если эксперимент TRXSS будет реализован при различных температурах, как использовалось в предыдущих исследованиях (14, 18), это может позволить нам оценить жесткость складывающегося ландшафта свободной энергии и распутать конформационную неоднородность на ранней стадии.Это добавление в конечном итоге будет способствовать топологическому картированию общих путей сворачивания с учетом ансамбля микросостояний и его конформаций. Такая возможность также будет важна для разработки новых вычислительных моделей. Фактически, построение моделей взаимодействия белков, которые могут правильно описывать неструктурированные состояния, — нетривиальная задача, прежде всего потому, что экспериментальных данных, которые могут подтвердить эти модели, очень не хватает. На неструктурированные состояния белков в большей степени влияет поведение поверхности раздела, такое как воздействие растворителя и связанные эффекты поляризации на поверхности белка, для которых современные модели все еще интенсивно разрабатываются.Наш метод может предоставить удобный инструмент для оценки их надежности. Таким образом, экспериментальные разработки в этой области могут внести большой вклад в развитие предсказательных возможностей недавно разработанных теоретических инструментов.

Рис. 5.

Схематическое изображение динамики сворачивания в воронкообразном ландшафте свободной энергии. При фотовосстановлении cyt-c гетерогенно заселенное начальное развернутое состояние (красные точки в проектируемой плоскости) претерпевает спонтанное сворачивание по множеству параллельных путей (белые стрелки).На основе анализа EOM с одной MD-траекторией длительностью 1 мкс были получены четыре конформации для представления развернутого состояния. Число репрезентативных развернутых конформаций несколько зависит от идентичности траектории. Неровные элементы в верхней части воронки свободной энергии могут быть связаны с существованием промежуточных звеньев (желтые точки в проекционной плоскости), которые посещаются на ранней стадии складчатости. Наблюдаемая кинетика вытянутого экспоненциального сворачивания является результатом наложения множества путей от развернутых подсостояний ( U i , i = 1 до N ) до свернутого состояния ( F ) через промежуточные подсостояния ( U i , i = 1 до N ), что указывает на конформационную гетерогенность в укладке cyt-c.

Методы

Подготовка проб.

Cyt-c сердца лошади, приобретенный у Sigma Aldrich, растворяли в 100 мМ Na-фосфата 20 мМ, 20 мМ NADH и 3,5 М GdnHCl при pH 7,0. Центрифугу с мембранным фильтром из ацетата целлюлозы использовали для удаления агрегированных частиц в растворе белка. После этого раствор белка барботировали газообразным азотом в течение 30 мин, чтобы получить бескислородный буфер. Образцы белка были приготовлены непосредственно перед экспериментами по рассеянию рентгеновских лучей.

Стационарные спектроскопические измерения.

Перед началом эксперимента с временным разрешением мы выполнили стационарные спектроскопические эксперименты с использованием спектроскопии УФ-видимого поглощения и УФ-спектроскопии кругового дихроизма (УФ-КД) (JASCO J-815) для проверки состояния образца белка.

Измерение кривой рассеяния рентгеновских лучей.

Данные стационарного рассеяния рентгеновских лучей для окисленной и восстановленной формы cyt-c были собраны на канале 14-ID-B в Advanced Photon Source.Для стационарного измерения восстановленного cyt-c окисленный cyt-c восстанавливали добавлением дитионита натрия (4 мМ) в бескислородный буфер. Во время измерения 1-мМ раствор cyt-c, растворенный в 100 мМ Na-фосфате, 20 мМ NADH и 3,5 M GdnHCl при pH 7,0, подавался в капиллярную проточную ячейку, чтобы избежать сигнала от поврежденного образца. Импульс рентгеновского зонда при 12 кэВ, генерируемый при работе в режиме 324 пучков на APS, доставлялся к образцу белка, и картины рассеяния рентгеновских лучей регистрировались с помощью детектора Mar165 CCD (Rayonix).Энергетический профиль импульса рентгеновского излучения, использованный для сбора картины рассеяния, был измерен с помощью фотодиода и использовался для структурного анализа данных рассеяния рентгеновских лучей, чтобы скорректировать полихроматичность теоретической кривой рассеяния (см. SI Приложение , Примечание 1 и Рис. S15, для подробностей).

Данные TRXSS были собраны на канале ID09B на Европейской установке синхротронного излучения (ESRF) в соответствии с установленным экспериментальным протоколом, основанным на схеме «накачка и зонд» (45–47, 50, 51).Для измерения 2-мМ раствор cyt-c, растворенный в буфере, который является таким же, как тот, который используется в стационарном измерении, вливали в капиллярную систему с помощью шприцевого насоса. Чтобы предотвратить повторное окисление во время измерения с временным разрешением, мы использовали герметичную циркуляционную систему, в которой основная масса раствора была полностью дегазирована. Кроме того, чтобы полностью исключить возможность того, что сложенная форма (уменьшенная форма), образованная как фотопродукты, может подвергнуться повторному окислению, часть образца, подвергнутая воздействию возбуждающего лазера и импульсов рентгеновского излучения, пропускалась и выбрасывалась.А именно, образец белка подвергался воздействию лазерного и рентгеновского импульсов только один раз. Раствор cyt-c облучали наносекундными (нс) лазерными импульсами с круговой поляризацией (Opotek Vibrant) с плотностью энергии 1 мДж / мм 2 при длине волны 355 нм и зондировали рентгеновскими импульсами, падающими с четко определенными временными задержками. Полихроматический рентгеновский зондирующий импульс с энергией 18 кэВ генерировался при работе в режиме 16 пучков на ESRF. Зависящие от времени картины рассеяния рентгеновских лучей регистрировались с помощью детектора Mar165 CCD (Rayonix), охватываемого до широкоугольной области.Картина рассеяния при отрицательной временной задержке (-50 мкс) также была собрана и использована в качестве эталона для расчета разностных кривых рассеяния с временным разрешением. Картина рассеяния при временной задержке -50 мкс содержит структурную информацию о начальном состоянии, в то время как данные при положительных временных задержках содержат вклады от смеси начального состояния и фотопродуктов. Разностные кривые рассеяния с временным разрешением ∆S ( q , t ) = S ( q , t ) — S ( q , −50 мкс) были получены путем вычитания кривой рассеяния при −50 мкс от кривых при положительных задержках.Кривые ∆S ( q , t ) дают информацию об изменении, вызванном фотовозбуждением лазера. Мы измерили кривые TRXSS в широком временном диапазоне от 31,6 мкс до 316 мс. При каждой временной задержке усреднялось более 300 кривых рассеяния для достижения высокого отношения сигнал / шум.

Доступность данных.

Все данные включены в рукопись SI и Приложение .

Благодарности

Мы выражаем признательность за вдохновляющую дискуссию с доктором.Хён Ву Ким из Корейского научно-исследовательского института химических технологий, обширная поддержка со стороны д-ра Ирины Кошелевой и д-ра Роберта Хеннинга из лучевой линии 14-ID в Advanced Photon Source во время сбора данных, а также первоначальная экспериментальная помощь от Марко Каммарата и Тинчери Нараянана из ESRF . Эксперименты по рассеянию рентгеновских лучей с временным разрешением и статическим рассеянием в растворе в этом исследовании были выполнены на канале ID09 в ESRF и на канале BioCARS 14-ID в Advanced Photon Source (США), соответственно.Использование усовершенствованного источника фотонов было поддержано Министерством энергетики США, Департаментом фундаментальных энергетических наук, Управлением науки в соответствии с контрактом DE-AC02-06Ch21357. Использование Сектора 14 BioCARS также было поддержано Национальными институтами здравоохранения, Национальным институтом общих медицинских наук, грантом R24GM111072. Работа поддержана Корейским национальным исследовательским фондом (2017R1A2B3004946). Работа поддержана Институтом фундаментальных наук (IBS-R004).

Сноски

  • Автор: T.W.K., Y.M.R. и H.I. спланированное исследование; T.W.K., S.J.L., J.J., J.G.K., H.K., J.C., J.H.L., M.W. и H.I. проведенное исследование; T.W.K., S.J.L., J.G.K., C.W.K., K.H.C. и Y.M.R. проанализированные данные; T.W.K., Y.M.R. и H.I. написал статью; и T.W.K., S.J.L., J.J., J.G.K., H.K., C.W.K., K.H.C., Y.M.R. и H.I. способствовал интерпретации результатов.

  • Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS. Д.Т. — приглашенный редактор по приглашению редакционной коллегии.

  • См. В Интернете сопутствующее содержание, например комментарии.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1913442117/-/DCSupplemental.

  • Copyright © 2020 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

Искусственный интеллект DeepMind делает гигантский скачок в решении белковых структур

Функция белка определяется его трехмерной формой.Кредит: DeepMind

.

Сеть искусственного интеллекта (AI), разработанная Google AI, ответвлением DeepMind, сделала гигантский скачок в решении одной из величайших задач биологии — определении трехмерной формы белка по его аминокислотной последовательности.

Программа DeepMind под названием AlphaFold превзошла около 100 других команд в двухгодичной задаче прогнозирования структуры белка под названием CASP, сокращенно от Critical Assessment of Structure Prediction. Результаты были объявлены 30 ноября в начале конференции — практически в этом году — которая подводит итоги работы.

«Это большое дело», — говорит Джон Моулт, вычислительный биолог из Университета Мэриленда в Колледж-Парке, который стал соучредителем CASP в 1994 году с целью улучшения вычислительных методов для точного предсказания структур белков. «В каком-то смысле проблема решена».

Возможность точно предсказать белковые структуры по их аминокислотной последовательности была бы огромным благом для наук о жизни и медицины. Это значительно ускорит усилия по пониманию строительных блоков клеток и сделает возможным более быстрое и продвинутое открытие лекарств.

AlphaFold занял первое место на последнем CASP — в 2018 году, первом году участия лондонской DeepMind. Но в этом году сеть глубокого обучения этого подразделения была на голову выше других команд и, по словам ученых, работала настолько ошеломляюще, что могла возвестить революцию в биологии.

«Это меняет правила игры», — говорит Андрей Лупас, биолог-эволюционист из Института биологии развития им. Макса Планка в Тюбингене, Германия, который оценивал эффективность различных команд в рамках CASP.AlphaFold уже помог ему найти структуру белка, которая беспокоила его лабораторию в течение десяти лет, и он ожидает, что это изменит то, как он работает, и какие вопросы он решает. «Это изменит медицину. Это изменит исследования. Это изменит биоинженерию. Это все изменит », — добавляет Лупас.

В некоторых случаях предсказания структуры AlphaFold были неотличимы от тех, которые были определены с использованием экспериментальных методов «золотого стандарта», таких как рентгеновская кристаллография и, в последние годы, криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ).AlphaFold может и не избавить от необходимости в этих трудоемких и дорогих методах — пока, — говорят ученые, но ИИ позволит изучать живые существа по-новому.

Проблема структуры

Белки — это строительные блоки жизни, ответственные за большую часть того, что происходит внутри клеток. Как работает белок и что он делает, определяется его трехмерной формой — «структура есть функция» — аксиома молекулярной биологии. Белки склонны принимать форму без посторонней помощи, руководствуясь только законами физики.

На протяжении десятилетий лабораторные эксперименты были основным способом получения хороших белковых структур. Первые полные структуры белков были определены, начиная с 1950-х годов, с использованием техники, в которой рентгеновские лучи направляются на кристаллизованные белки, а дифрагированный свет переводится в координаты атомов белка. Рентгеновская кристаллография позволила получить львиную долю белковых структур. Но за последнее десятилетие крио-ЭМ стала излюбленным инструментом многих структурно-биологических лабораторий.

Ученые давно задавались вопросом, как составные части белка — цепочка различных аминокислот — отображают множество изгибов и складок его окончательной формы. Исследователи утверждают, что ранние попытки использовать компьютеры для предсказания структуры белков в 1980-х и 1990-х годах не увенчались успехом. Высокие заявления о методах в опубликованных статьях имели тенденцию рассыпаться, когда другие ученые применяли их к другим белкам.

Moult запустил CASP, чтобы усилить эти усилия. Событие ставит перед командами задачу предсказать структуры белков, которые были решены с помощью экспериментальных методов, но структуры которых не были обнародованы.Молт считает, что эксперимент — он не называет его соревнованием — значительно улучшил ситуацию, требуя времени на преувеличенные заявления. «Вы действительно понимаете, что выглядит многообещающим, что работает и от чего следует отказаться», — говорит он.

Источник: DeepMind

Выступление

DeepMind на выставке CASP13 в 2018 году поразило многих ученых в этой области, которая долгое время была оплотом небольших академических групп. Но его подход в целом был похож на подходы других команд, применяющих ИИ, говорит Дзинбо Сюй, вычислительный биолог из Чикагского университета, штат Иллинойс.

Первая итерация AlphaFold применила метод искусственного интеллекта, известный как глубокое обучение, к структурным и генетическим данным для прогнозирования расстояния между парами аминокислот в белке. На втором этапе, не использующем ИИ, AlphaFold использует эту информацию для создания «консенсусной» модели того, как должен выглядеть белок, — говорит Джон Джампер из DeepMind, возглавляющий проект.

Команда попыталась развить этот подход, но в итоге упала. Таким образом, по словам Джампера, компания изменила тактику и разработала сеть искусственного интеллекта, которая включала дополнительную информацию о физических и геометрических ограничениях, которые определяют способ сворачивания белка.Они также поставили перед ним более сложную задачу: вместо того, чтобы предсказывать отношения между аминокислотами, сеть предсказывает окончательную структуру последовательности целевого белка. «Это намного более сложная система, — говорит Джампер.

Поразительная точность

CASP проводится в течение нескольких месяцев. Целевые белки или части белков, называемые доменами — всего около 100 — выпускаются на регулярной основе, и у команд есть несколько недель, чтобы представить свои прогнозы структуры. Затем группа независимых ученых оценивает прогнозы, используя показатели, позволяющие определить, насколько предсказанный белок похож на экспериментально определенную структуру.Оценщики не знают, кто делает прогноз.

Прогнозы AlphaFold поступали под названием «группа 427», но поразительная точность многих из его записей выделяла их, — говорит Лупас. «Я догадался, что это AlphaFold. У большинства людей это было, — говорит он.

Некоторые прогнозы были лучше других, но почти две трети были сопоставимы по качеству с экспериментальными структурами. В некоторых случаях, говорит Моулт, было неясно, было ли несоответствие между предсказаниями AlphaFold и экспериментальным результатом ошибкой предсказания или артефактом эксперимента.

Прогнозы AlphaFold плохо соответствовали экспериментальным структурам, определенным с помощью метода, называемого спектроскопией ядерного магнитного резонанса, но это могло быть связано с тем, как необработанные данные преобразуются в модель, говорит Моулт. Сеть также изо всех сил пытается смоделировать отдельные структуры в белковых комплексах или группах, в результате чего взаимодействие с другими белками искажает их форму.

В целом, команды предсказали структуры в этом году более точно по сравнению с последним CASP, но большая часть прогресса может быть отнесена к AlphaFold, говорит Моулт.По словам Моулта, в отношении целевых белков, которые считаются умеренно сложными, лучшие результаты других команд обычно набирали 75 баллов по 100-балльной шкале точности прогнозов, тогда как AlphaFold набирал около 90 баллов по тем же целям.

Около половины команд упомянули «глубокое обучение» в аннотации, описывающей свой подход, говорит Моулт, предполагая, что ИИ оказывает широкое влияние на эту сферу. Большинство из них были из академических команд, но Microsoft и китайская технологическая компания Tencent также вошли в CASP14.

Мохаммед Аль-Кураиши, вычислительный биолог из Колумбийского университета в Нью-Йорке и участник CASP, хочет вникнуть в подробности выступления AlphaFold на конкурсе и узнать больше о том, как работает система, когда команда DeepMind представит свой подход на 1 декабря. Возможно — но маловероятно, — говорит он, — что более легкий, чем обычно, сбор целевых белков повлиял на производительность. Аль-Кураиши сильно догадывается, что AlphaFold изменит мир.

«Я думаю, будет справедливо сказать, что это будет очень разрушительным для области предсказания структуры белка.Я подозреваю, что многие уйдут с поля, поскольку основная проблема, возможно, уже решена », — говорит он. «Это прорыв первого порядка, безусловно, один из самых значительных научных результатов в моей жизни».

Демис Хассабис, исполнительный директор DeepMind, говорит, что компания изучает то, что биологи хотят от AlphaFold. Фото: OLI SCARFF / AFP / Getty

Более быстрые структуры

Прогноз AlphaFold помог определить структуру бактериального белка, который лаборатория Лупаса пыталась взломать в течение многих лет.Команда Лупаса ранее собирала необработанные данные дифракции рентгеновских лучей, но преобразование этих структур, подобных Роршаху, в структуру требует некоторой информации о форме белка. Уловки для получения этой информации, как и других инструментов прогнозирования, не увенчались успехом. «Модель из группы 427 дала нам нашу структуру за полчаса, после того как мы потратили десять лет, пробуя все», — говорит Лупас.

Демис Хассабис, соучредитель и главный исполнительный директор DeepMind, говорит, что компания планирует сделать AlphaFold полезной, чтобы ее могли использовать другие ученые.(Ранее он опубликовал достаточно подробностей о первой версии AlphaFold, чтобы другие ученые могли воспроизвести этот подход.) AlphaFold может потребоваться несколько дней, чтобы придумать прогнозируемую структуру, которая включает оценки надежности различных участков белка. «Мы только начинаем понимать, чего бы хотели биологи», — добавляет Хассабис, который рассматривает открытие лекарств и разработку белков как потенциальные приложения.

В начале 2020 года компания опубликовала прогнозы структур нескольких белков SARS-CoV-2, которые еще не были определены экспериментально.По словам Стивена Брохона, молекулярного нейробиолога из Калифорнийского университета в Беркли, предсказания DeepMind для белка под названием Orf3a оказались очень похожими на предсказания, полученные позже с помощью крио-ЭМ. «То, что они смогли сделать, очень впечатляет», — добавляет он.

Влияние в реальном мире

AlphaFold вряд ли закроет лаборатории, такие как Brohawn, которые используют экспериментальные методы для определения структур белков. Но это может означать, что менее качественные и простые для сбора экспериментальные данные — это все, что нужно для создания хорошей структуры.Некоторые приложения, такие как эволюционный анализ белков, будут процветать, потому что цунами доступных геномных данных теперь может быть надежно переведено в структуры. «Это даст возможность новому поколению молекулярных биологов задавать более сложные вопросы», — говорит Лупас. «Это потребует больше размышлений и меньше дозирования».

«Это проблема, которую я начал думать, что не будет решен при моей жизни», — говорит Джанет Торнтон, структурный биолог из Европейской лаборатории молекулярной биологии Европейского института биоинформатики в Хинкстоне, Великобритания, и бывший эксперт CASP.Она надеется, что этот подход поможет пролить свет на функцию тысяч нерешенных белков в геноме человека и разобраться в вариациях генов, вызывающих болезни, которые различаются у разных людей.

Работа AlphaFold также знаменует собой поворотный момент для DeepMind. Компания наиболее известна тем, что использует ИИ для освоения таких игр, как го, но ее долгосрочная цель — разработать программы, способные обеспечить широкий, человеческий интеллект. По словам Хассабиса, решение грандиозных научных задач, таких как предсказание структуры белка, является одним из наиболее важных приложений, которые может сделать его ИИ.«Я считаю, что это самое важное, что мы сделали с точки зрения реального воздействия».

AlphaFold: решение грандиозной проблемы биологии 50-летней давности

Мы также увидели признаки того, что прогнозирование структуры белка может быть полезным в будущих усилиях по реагированию на пандемию, как один из многих инструментов, разработанных научным сообществом. Ранее в этом году мы предсказали несколько белковых структур вируса SARS-CoV-2, включая ORF3a, структура которого ранее была неизвестна.В CASP14 мы предсказали структуру другого белка коронавируса, ORF8. Впечатляюще быстрая работа экспериментаторов подтвердила структуры как ORF3a, так и ORF8. Несмотря на их сложный характер и наличие очень небольшого количества связанных последовательностей, мы достигли высокой степени точности обоих наших прогнозов по сравнению с их экспериментально определенными структурами.

Мы не только ускоряем понимание известных болезней, но и рады возможности этих методов исследовать сотни миллионов белков, для которых у нас в настоящее время нет моделей, — обширную территорию с неизвестной биологией.Поскольку ДНК определяет аминокислотные последовательности, которые составляют структуры белков, революция в геномике сделала возможным считывание последовательностей белков из естественного мира в массовом масштабе — с 180 миллионами последовательностей белков и подсчетом в базе данных Universal Protein (UniProt). Напротив, учитывая экспериментальную работу, необходимую для перехода от последовательности к структуре, только около 170 000 белковых структур находятся в банке данных о белках (PDB). Среди неопределенных белков могут быть некоторые с новыми интересными функциями, и — так же, как телескоп помогает нам заглянуть глубже в неизвестную вселенную — такие методы, как AlphaFold, могут помочь нам найти их.

Открывая новые возможности

AlphaFold — одно из наших самых значительных достижений на сегодняшний день, но, как и во всех других научных исследованиях, есть еще много вопросов, на которые нужно ответить. Не всякая структура, которую мы прогнозируем, будет идеальной. Еще многое предстоит узнать, в том числе о том, как несколько белков образуют комплексы, как они взаимодействуют с ДНК, РНК или небольшими молекулами, и как мы можем определить точное местоположение всех боковых цепей аминокислот. В сотрудничестве с другими можно многое узнать о том, как лучше всего использовать эти научные открытия при разработке новых лекарств, о способах управления окружающей средой и многом другом.

Для всех нас, работающих над вычислительными методами и методами машинного обучения в науке, такие системы, как AlphaFold, демонстрируют потрясающий потенциал ИИ как инструмента для фундаментальных открытий. Подобно тому, как 50 лет назад Анфинсен поставил задачу, выходящую за пределы возможностей науки в то время, многие аспекты нашей Вселенной остаются неизвестными. Объявленный сегодня прогресс вселяет в нас уверенность в том, что ИИ станет одним из самых полезных инструментов человечества в расширении границ научных знаний, и мы с нетерпением ждем впереди многих лет упорной работы и открытий!


Пока мы не опубликуем статью об этой работе, пожалуйста, цитируйте:

Высокоточное прогнозирование структуры белка с использованием глубокого обучения

Джон Джампер, Ричард Эванс, Александр Прицель, Тим Грин, Майкл Фигурнов, Кэтрин Туньясувунакул, Олаф Роннебергер, Расс Бейтс, Августин Жидек, Алекс Бриджленд, Клеменс Мейер, Саймон А.А. Коль, Анна Потапенко, Эндрю Дж. Баллард, Эндрю Ромера, Бернардино -Паредес, Станислав Николов, Ришуб Джейн, Йонас Адлер, Тревор Бэк, Стиг Петерсен, Дэвид Рейман, Мартин Штайнеггер, Михалина Пачольска, Дэвид Сильвер, Ориол Виньялс, Эндрю У. Старший, Корай Кавукчуоглу, Пушмит Кохли, Демис Хассабис.

в Четырнадцатой критической оценке методов прогнозирования структуры белка (тезисы), 30 ноября — 4 декабря 2020 г. Получено отсюда.

Мы находимся в самом начале изучения того, как лучше всего дать возможность другим группам использовать наши предсказания структуры, наряду с подготовкой рецензируемой статьи для публикации. Хотя наша команда не сможет ответить на все запросы, если AlphaFold может иметь отношение к вашей работе, отправьте несколько строк об этом по адресу alphafold @ deepmind.com. Мы свяжемся с вами, если появятся возможности для дальнейшего изучения.

Специальный выпуск: сворачивание и неправильное сворачивание белков

Уважаемые коллеги,

Способность белковых цепей самопроизвольно формировать свои пространственные структуры была давней загадкой в ​​молекулярной биологии, особенно потому, что измеренные скорости спонтанного сворачивания варьируются от микросекунд до часов: разница (по крайней мере, на 11 порядков) сродни разница между продолжительностью жизни комара и возрастом Вселенной.Теперь, когда эта загадка решена в своей основе, основной интерес сместился (1) к «природно неупорядоченным» белкам, которые обычно получают свою определенную структуру только при взаимодействии с целевыми молекулами, и (2) к способности многих белковые цепи с образованием не только «нативных» (правильно работающих) трехмерных структур, но и других («неправильно свернутых») структур, что также часто связано с взаимодействием этих цепей с другими молекулами.

Эти реконструкции белковых структур иногда вызывают смертельные заболевания, и поэтому проблема сворачивания и неправильного сворачивания белков вызывает большой медицинский интерес.На поле боя ждут много новых вызовов.

Чтобы проиллюстрировать читателям «Биомолекул» важность проблемы сворачивания и неправильного сворачивания белков как междисциплинарной области исследований, этот специальный выпуск предназначен для демонстрации различных аспектов сворачивания, неправильного сворачивания и разворачивания белков.

Мы с нетерпением ждем ваших отзывов,

Проф. Д-р Алексей Финкельштейн
Приглашенный редактор

Информация для подачи рукописей

Рукописи должны быть представлены онлайн по адресу www.mdpi.com, зарегистрировавшись и войдя на этот сайт. После регистрации щелкните здесь, чтобы перейти к форме отправки. Рукописи можно подавать до установленного срока. Все статьи будут рецензироваться. Принятые статьи будут постоянно публиковаться в журнале (как только они будут приняты) и будут перечислены вместе на веб-сайте специального выпуска. Приглашаются исследовательские статьи, обзорные статьи, а также короткие сообщения. Для запланированных статей название и краткое резюме (около 100 слов) можно отправить в редакцию для объявления на этом сайте.

Представленные рукописи не должны были публиковаться ранее или рассматриваться для публикации в другом месте (за исключением трудов конференции). Все рукописи проходят тщательное рецензирование путем простого слепого рецензирования. Руководство для авторов и другая важная информация для подачи рукописей доступна на странице Инструкции для авторов. Biomolecules — это международный рецензируемый ежемесячный журнал с открытым доступом, публикуемый MDPI.

Пожалуйста, посетите страницу Инструкции для авторов перед отправкой рукописи.Плата за обработку статьи (APC) для публикации в этом журнале с открытым доступом составляет 2000 швейцарских франков.
Представленные документы должны быть хорошо отформатированы и написаны на хорошем английском языке. Авторы могут использовать MDPI
Услуги редактирования на английском языке перед публикацией или во время редактирования автора.

Protein Folding — обзор

4.7 Связывание белков и связанные с ними заболевания

Белки синтезируются на рибосомах в виде возникающих полипептидов в просвете эндоплазматического ретикулума (ER). Аминокислотная последовательность белков, определяющая вторичные и третичные структуры, определяется нуклеотидной последовательностью мРНК.В свою очередь, последовательности мРНК определяются последовательностями ДНК (главы 23–25232425). Как обсуждалось ранее, классические эксперименты Полинга и Анфинсена привели к концепции, что определенные ключевые аминокислоты в правильных положениях необходимы для сворачивания белков в трехмерную, функциональную и уникальную конформацию. Удивительно, что из сотен миллионов конформационных возможностей только одна конформационная форма связана с функциональным белком. В процессе направления и нацеливания сворачивания промежуточных полипептидов в полностью свернутые структуры в некоторых случаях помогают белки, известные как , молекулярные шапероны (также называемые шаперонинами ) (рис. 4-13).

РИСУНОК 4-13. Путь сворачивания белка. Нормальное сворачивание происходит с помощью шаперонов и других факторов. Неправильная укладка полипептидов может привести к нацеливанию на неподходящие клеточные участки, к деградации как части процесса контроля качества или к агрегации. Агрегированный продукт часто устойчив к протеолизу и образует агрегаты, такие как амилоидные бляшки.

Шапероны обратимо связываются с развернутыми полипептидными сегментами и предотвращают их неправильную укладку и преждевременную агрегацию.Этот процесс включает в себя затраты энергии на гидролиз АТФ. Основным классом шаперонов является белков теплового шока (hsp), которые синтезируются как в прокариотических, так и в эукариотических клетках в ответ на тепловой шок или другие стрессы (например, воздействие свободных радикалов). Существует много классов шаперонов теплового шока (HSP-60, HSP-70 и HSP-90), которые присутствуют в различных органеллах клетки. Шапероны HSP-70 содержат два домена: домен АТФазы и домен связывания пептида.Они стабилизируют возникающие полипептиды, а также способны преобразовывать денатурированные формы полипептидов. Семейство шаперонов HSP-70 демонстрирует высокую степень гомологии последовательностей среди различных видов (например, белки E. coli и HSP-70 человека демонстрируют 50% гомологию последовательностей).

Другой шаперон, калнексин, представляет собой 90 кДа Са 2+ -связывающий белок и является интегральным мембранным фосфопротеином ER. Калнексин контролирует экспорт вновь синтезированных гликопротеинов путем образования комплексов с неправильно свернутыми гликопротеинами, которые подверглись гликозилированию (глава 16).Если белок не может быть свернут в правильную конформацию, шапероны способствуют разрушению. Процесс сворачивания также облегчается ионным окружением, кофакторами и ферментами. Например, на фолдинг влияет протеин-дисульфид-изомераза, которая катализирует образование правильных дисульфидных связей, и пептидил-пролилизомеразы, которые катализируют цис-транс-изомеризацию определенных пептидных связей аминокислота-пролин.

Известно несколько нарушений сворачивания белков, которые имеют характерный патологический признак агрегации белков и отложений внутри и вокруг клеток.Белковые отложения называются амилоидом, а болезнь известна как амилоидоз . Заболевания сворачивания белка, также известные как конформационные заболевания, имеют много различных этиологий, таких как изменения в первичной структуре белков, дефекты шаперонов и несоответствующее присутствие или влияние других белков. Список нарушений сворачивания белков приведен в таблице 4-1; некоторые обсуждаются ниже, а другие — в последующих главах. Общим, но не неизменным аспектом конформационных белковых заболеваний является то, что агрегация полипептидов состоит из β-структур. Это в первую очередь связано с переходом от α -спиральной структуры к β -структуре. Другой особенностью является то, что агрегаты устойчивы к нормальному протеолизу.

ТАБЛИЦА 4-1. Примеры заболеваний сворачивания белка *

ros57 Взаимодействие Hsp70 и калнексина

9057 Мисфолдинг

9057

α

Болезнь агрегации

амилоидная

агрегации

Семейную амилоидоз

агрегация

агрегации

наследственной гиперхолестеринемии

905 73 β -гексозаминидаза

прогрессирующий синдром

Заболевание Участвующий мутантный белок / белок Молекулярный фенотип
Неспособность сворачиваться

Cystic

Синдром Марфана Фибриллин Мисфолдинг
Боковой амиотрофический склероз Супероксиддисмутаза Мисфолдинг

Мисфолдинг

Мисфолдинг

Мисфолдинг Misfolding α -Кетоокислотный дегидрогеназный комплекс Неправильная сборка / неправильная укладка
Рак p53 Неправильная укладка / измененное взаимодействие Hsp70
Несовершенный остеогенез 3 Проколл Неправильная сборка / измененная экспрессия BiP
Токсические складки
Скрэпи / Крейтцфельдта-Якоба / семейная бессонница Прионный белок

транстиретина / лизоцим
Катаракты кристаллин
Mislocalization вследствие неправильного сворачивания
Рецептор ЛПНП Неправильный оборот
α 1 -Дефицит антитрипсина α 1 -Антитрипсин Неправильный оборот
Болезнь Тея-Сакса Неправильная торговля
Пигментный ретинит Родопсин Неправильная торговля
Лепрехаунизм Инсулиновый рецептор
Неправильная торговля инсулином в отношении памяти, познания, стабильности поведения и независимой функции был описан Alois Alzheimer и известен как болезнь Альцгеймера (AD).Возраст — важный фактор риска AD; он поражает 10% людей старше 65 лет и около 40% людей старше 85 лет. Характерные нейропатологические изменения включают образование внеклеточных нейритных бляшек и внутринейрональных клубков с соответствующей потерей нейронов в гиппокампе и неокортексе (рис. 4-14).

РИСУНОК 4-14. Срез коры головного мозга пациента с болезнью Альцгеймера, содержащий нейрофибриллярный клубок (A) и нейритную бляшку (B). Срез обработали красителем Бильшеховского.(Любезно предоставлено Джоном М. Хардманом.)

Основным компонентом внеклеточных бляшек является амилоид , амилоид , β-белок (A β ), который объединяется в филаменты 8 нм. β представляет собой пептид из 40 или 42 аминокислотных остатков и протеолитически получен из трансмембранного гликопротеина, известного как белок-предшественник амилоида β- ( β APP). Ферменты, которые расщепляют β APP до A β , известны как секретазы. β APP широко экспрессируется, особенно в головном мозге, и его ген локализован на хромосоме 21q. Два основных наблюдения помогли понять роль пептидов A β в патологии болезни Альцгеймера. Во-первых, пациенты с синдромом Дауна имеют трисомию 21 (то есть три хромосомы 21 вместо двух), обнаруживают отложения A β и развивают классические признаки болезни Альцгеймера в возрасте 40 лет или раньше. Во-вторых, несколько миссенс-мутаций в β APP были идентифицированы в случаях аутосомно-доминантной болезни Альцгеймера.Эти доминантные мутации в APP β отрицательно влияют на действие секретаз либо за счет увеличения абсолютной скорости экскреции A β (N-концевые мутации), либо за счет увеличения отношения A β 42 к A β . 40 (С-концевые мутации).

Наследственные заболевания болезни Альцгеймера составляют менее 1% всех случаев. Пептиды A β агрегируют с образованием β -структур, ведущих к фибриллам. Пептиды A β 42 более нейротоксичны и вызывают токсические эффекты посредством многих взаимосвязанных механизмов.Они могут включать окислительное повреждение, изменения внутриклеточного гомеостаза Ca 2+ , реорганизацию цитоскелета и действия цитокинов.

Внутринейрональные клубки представляют собой пучки длинных парных спиральных филаментов, которые состоят из белка тау, ассоциированного с микротрубочками. Нормальная функция тау-белка заключается в стабилизации микротрубочек в нейронах путем усиления полимеризации тубулина. Обычно тау-белок растворим; однако, когда он чрезмерно фосфорилирован, он превращается в нерастворимый нитевидный полимер.Нарушение регуляции процессов фосфорилирования / дефосфорилирования объясняется повышенной активностью определенных киназ и пониженной активностью определенных фосфатаз. В то время как бляшки являются патогномоничными для БА, клубки обнаруживаются при различных этиологически неврологических заболеваниях. Нарушения аномального гиперфосфорилирования и аберрантной агрегации тау-белка в фибриллярные полимеры известны как таупатий. Примерами таупатий в дополнение к AD являются прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, кортикобазальная дегенерация, и лобно-височная деменция.

Два других гена в дополнение к β APP были вовлечены в раннее начало аутосомно-доминантных форм болезни Альцгеймера. Два других причинных гена расположены на хромосомах 14 и 1 и кодируют трансмембранные белки пресенилин 1 (состоящий из 467 аминокислотных остатков) и пресенилина 2 (состоящий из 448 аминокислотных остатков). Эти белки синтезируются в нейронах, но их функции неизвестны.Однако мутации в генах пресенилина приводят к избыточной продукции пептидов A β 42 .

Спорадические формы болезни Альцгеймера, на которые приходится 90% всех случаев, являются сложными заболеваниями и могут представлять собой комбинированное действие факторов окружающей среды и генетических особенностей, проявляющихся в течение длительного времени. Было обнаружено, что различные формы полиморфного гена для аполипопротеина E (апо E), который находится на хромосоме 19, чаще встречаются у людей с болезнью Альцгеймера.Существует три аллеля гена апо E с шестью комбинациями: ε 2 / ε 2 , ε 3 / ε 3 , ε 4 / ε 4 , ε 2 / ε 3 , ε 2 / ε 4 и ε 3 / ε 4 . Апо E представляет собой липидный белок-носитель, который синтезируется в основном в печени; однако он также синтезируется в астроцитах и ​​нейронах.Функция белков апо E в метаболизме липопротеинов и их связь с преждевременным атеросклерозом обсуждаются в главе 20.

Из нескольких генотипов апо E приобретение двух аллелей апо E ε 4 может увеличить риск болезни Альцгеймера. заболевание до восьмикратного. Каждая копия гена апо E увеличивает риск и сдвигает начало в более ранний возраст. Биохимический механизм, с помощью которого белок апо E ε 4 участвует в образовании клубков и бляшек, неясен.Было предложено несколько механизмов, а именно взаимодействие с тау-белком, образование и клиренс пептидов A β .

Фармакологическая терапия болезни Альцгеймера состоит из коррекции холинергического дефицита путем введения ингибиторов ацетилхолинэстеразы (например, такрина, донепезила). Эстрогеновая терапия у женщин с болезнью Альцгеймера ассоциируется с улучшением когнитивных функций.Благоприятный эффект эстрогена может быть обусловлен холинергическим и нейротрофическим действием. Другие терапевтические стратегии направлены на ингибирование или уменьшение образования нейротоксических пептидов. Кроме того, могут оказаться полезными препараты, которые избирательно переваривают агрегированные пептиды. Экспериментальная вакцина, содержащая пептид AP, вводимая мышам, продуцирующим бляшки, приводит к меньшему образованию бляшек у молодых мышей и исчезновению бляшек у старых мышей. Изменения образования бляшек у мышей были связаны с сохранением памяти и способности к обучению.Вакцинация не вызвала аутоиммунного ответа или токсической реакции у экспериментальных животных. Таким образом, эти исследования послужили толчком для разработки вакцины для человека.

При обследовании пациента на болезнь Альцгеймера важно исключить другие поддающиеся лечению причины деменции путем определения критических биохимических и клинических параметров. Некоторые из поддающихся лечению, относительно распространенных патологий, вызывающих деменцию, включают злоупотребление наркотиками, электролитный дисбаланс, нарушения щитовидной железы и дефицит витамина B 12 ; реже встречаются опухоли, инсульт и энцефалопатия Вернике.

Транстиретиновый амилоидоз (также называемый семейной амилоидной полинейропатией) — аутосомно-доминантный синдром, характеризующийся периферической невропатией. Это заболевание является результатом одной из пяти мутаций, выявленных на данный момент в гене транстиретина. Транстиретин также называют преальбумином (хотя он не имеет структурного отношения к альбумину), потому что он перемещается впереди альбумина при стандартном электрофорезе при pH 8,6. Транстиретин синтезируется в печени и представляет собой нормальный белок плазмы с концентрацией 20-40 мг / дл.Он транспортирует тироксин и связывающий ретинол белок (Глава 38). Концентрация транстиретина значительно снижается при недостаточности питания, а его уровни в плазме являются диагностическим признаком нарушения питания (Глава 17).

Ген транстиретина находится на хромосоме 18 и экспрессируется конститутивным образом. Первичная структура транстиретина состоит из 127 аминокислотных остатков и восьми структур β -листов, расположенных в антипараллельной конформации на параллельных плоскостях (рис. 4-15).

РИСУНОК 4-15. Структура транстиретина. Молекула содержит восемь антипараллельных β -цепей (A-H), расположенных в двух параллельных плоскостях. Циркулирующая форма транстиретина — тетрамер. Некоторые мутации в гене транстиретина связаны с амилоидозом, и показаны восемь аминокислотных изменений, вызывающих это заболевание. В плазме транстиретин представляет собой тетрамер, состоящий из идентичных мономеров. По-видимому, мутации вызывают агрегацию мономерного развернутого промежуточного продукта транстиретина с образованием нерастворимых β -амилоидных фибрилл.

Нарушения сворачивания белков необычной природы могут составлять группу из трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSE) с участием белков, называемых прионами (PrP). Эти расстройства, известные как прионных болезней, , характеризуются отложением амилоида в головном мозге животных и человека. Клинические признаки включают неврологические симптомы с потерей контроля над моторикой, слабоумие, паралич и истощение. Инкубационные периоды прионных болезней составляют месяцы у животных и годы у людей.Никакого лечения ни от одного из этих заболеваний не существует. TSE встречаются у нескольких видов животных и людей, и животные модели сыграли важную роль в расшифровке молекулярной основы этих заболеваний. Примеры прионных заболеваний, встречающихся у животных и человека:

Кошки : трансимиссибельная кошачья энцефалопатия
Коровы SE: 106bovine spongpath : трансмиссивная норковая энцефалопатия
Мул-олень и лось: : хроническая истощающая болезнь
Овцы
Овцы : 6 9057 Болезнь Крейтцфельда-Якоба (CJD), Куру, синдром фатально-семейной бессонницы, и Болезнь Герстманна-Штрауслера-Шенкера

TSE могут проявлять наследственные, инфекционные и спорадические проявления.Кроме того, наследственное заболевание также может быть инфекционным. БКЯ встречается как наследственное аутосомно-доминантное заболевание, так и в трансмиссивной форме. В гипотезе «только белок» аномальный прионный белок, введенный из внешних источников или продуцируемый мутантным геном прионного белка, влияет на нормальную укладку белка и сдвигает укладку прионного белка в сторону образования аномального прионного белка. Превращение нормального прионного белка, функция которого неизвестна, в аберрантную форму включает в себя конформационное изменение, а не ковалентную модификацию.Аномальный прионный белок функционирует как семя, которое индуцирует нормальный клеточный прионный белок по отношению к аномальным амилоидогенным, богатым, β -структурным белкам, которые могут размножаться и передаваться другим клеткам. Агрегированная форма прионного белка, образующая амилоид, устойчива к протеолизу.

Превращение природного протеазочувствительного прионного протеина в протеазорезистентную форму происходит in vitro путем смешивания двух протеинов. Однако эти устойчивые к протеазам прионные белки не заразны.Таким образом, в гипотезе «только белковой» прионной инфекции приобретение аберрантной конформации недостаточно для распространения инфекционности. Однако в дрожжевой системе ( Saccharomyces cerevisiae ) аномальная прионная форма дрожжевого белка, введенная путем слияния липосом, способна вызвать самораспространяющееся конформационное изменение нормальных белков, которые накапливаются в виде агрегатов. Агрегаты передаются дочерним дрожжевым клеткам вместе с распространением аномального фенотипа.

Недавно возникла серьезная проблема общественного здравоохранения, когда было показано, что прионная болезнь крупного рогатого скота может преодолевать видовые барьеры и инфицировать людей. Это произошло, когда крупный рогатый скот кормился мукой из овец, зараженных скрепи. У крупного рогатого скота развился BSE (обычно называемый «коровьим бешенством»). Впоследствии, когда люди потребляли зараженную прионами говядину, у небольшого числа людей, в основном в Великобритании, примерно через пять лет развился вариант CJD (vCJD). Вариантная форма CJD — это уникальная форма прионного заболевания, встречающаяся в гораздо более молодой популяции, чем можно было бы ожидать от наследственной или спорадической CJD.И BSE, и vCJD имеют много схожих патологических характеристик, предполагающих этиологическую связь между vCJD человека и BSE крупного рогатого скота.

Белок-супрессор опухолей p 53 представляет собой еще один пример неправильного свертывания белка, который может привести к патологическим эффектам, в данном случае раку ( p относится к белку, а 53 — к его приблизительной молекулярной массе 53000). Ген p 53 расположен на коротком плече хромосомы 17 (17 p ) и кодирует фосфопротеин из 393 аминокислот.При многих формах рака мутирован ген p 53, и отсутствие нормального белка p 53 было связано с развитием 40% случаев рака у человека.

Нормальный p 53 действует как опухолевый супрессор и является фактором транскрипции, который обычно участвует в регуляции нескольких генов, необходимых для контроля роста клеток , репарации ДНК, и апоптоза (запрограммированная гибель клеток) . Нормальный p 53 представляет собой тетрамер, и он связывается с ДНК специфическим для последовательности образом.Один из генов, регулируемых p53, продуцирует белок, известный как p 21, который вмешивается в клеточный цикл, связываясь с циклинкиназами. Другие гены, регулируемые p 53, — это MDM2 и BAX. Первый ген кодирует белок, который ингибирует действие p 53, действуя как часть механизма регуляторной обратной связи. Считается, что белок, продуцируемый геном BAX, играет роль в апоптозе, индуцированном p 53 .

Большинство мутаций генов p 53 представляют собой соматические миссенс-мутации, связанные с заменами аминокислот в ДНК-связывающем домене.Мутантные формы p 53 представляют собой неправильно свернутые белки с аномальной конформацией и неспособностью связываться с ДНК, или они менее стабильны. Лица с редким заболеванием синдром Ли-Фраумени, (аутосомно-доминантный признак) имеют один мутировавший ген p 53 и один нормальный ген p 53. Эти люди имеют повышенную предрасположенность ко многим видам рака, таким как лейкемия, карциномы груди, саркомы мягких тканей, опухоли головного мозга и остеосаркомы.

В настоящее время проводятся клинические испытания, чтобы выяснить, оказывает ли введение нормального гена p 53 в опухолевые клетки с помощью генной терапии (Глава 23) положительный эффект при лечении рака.Ранние результаты генной терапии p 53 показывают, что она может уменьшить опухоль, запуская апоптоз.

Туда и обратно: два взгляда на загадку сворачивания белка

Способность белковых цепей самопроизвольно формировать свои пространственные структуры — давняя загадка молекулярной биологии. Экспериментально измеренные времена сворачивания однодоменных глобулярных белков колеблются от микросекунд до часов: разница (10-11 порядков) такая же, как между продолжительностью жизни комара и возрастом Вселенной.В этом обзоре описаны физические теории скорости преодоления барьера свободной энергии, разделяющего нативно свернутые (N) и развернутые (U) состояния белковых цепей в обоих направлениях: «U-to-N» и «N-to-U». В теории скоростей сворачивания белков особую роль играет точка термодинамического (и кинетического) равновесия между нативным и развернутым состоянием цепи; здесь теория принимает простейший вид. Парадоксально, но теоретическую оценку времени сворачивания легче получить, рассматривая разворачивание белка (переход «N-to-U»), чем сворачивание, потому что легче наметить хороший путь разворачивания любой структуры, чем хороший сворачивание. путь, ведущий к стабильной складке, который еще неизвестен для складывающейся белковой цепи.А поскольку скорости прямой и обратной реакций равны в точке равновесия (как следует из принципа физического «детального баланса»), расчетное время складывания может быть получено из расчетного времени развертывания. Теоретический анализ перехода «N-to-U» очерчивает диапазон скоростей сворачивания белков в хорошем согласии с экспериментом. Теоретический анализ сворачивания (переход «U-to-N»), выполненный на уровне образования и сборки вторичных структур белка, очерчивает верхний предел времени сворачивания белка (т.е.е. времени поиска наиболее устойчивой складки). Обе теории приводят, по сути, к одним и тем же результатам; это не удивительно, потому что они описывают преодоление одного и того же барьера свободной энергии, хотя путь к вершине этого барьера со стороны развернутого состояния сильно отличается от пути со стороны нативного состояния; и обе теории согласуются с экспериментом. Кроме того, они предсказывают максимальный размер белковых доменов, которые сворачиваются исключительно под термодинамическим (а не кинетическим) контролем, и объясняют наблюдаемый максимальный размер «складываемых» белковых доменов.


Ключевые слова:

Складная воронка; Ландшафт свободной энергии; Парадокс Левинталя; Разделение фаз; Сворачивание белков; Сборка вторичной структуры белка.

Интерактивный визуальный симулятор сворачивания белка на основе расстояния

Образец цитирования: McGehee AJ, Bhattacharya S, Roche R, Bhattacharya D (2020) PolyFold: интерактивный визуальный симулятор сворачивания белка на основе расстояния.PLoS ONE 15 (12):
e0243331.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0243331

Редактор: Ян Чжан, Мичиганский университет, США

Поступило: 14 августа 2020 г .; Дата принятия: 18 ноября 2020 г .; Опубликовано: 3 декабря 2020 г.

Авторские права: © 2020 McGehee et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана Национальным научным фондом CAREER Award DBI-1942692 для DB, грантом Национального научного фонда IIS-2030722 для DB и наградой Национального института общих медицинских наук за максимальные исследования исследователей (MIRA). ) R35GM138146 в DB. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Вычислительное предсказание структуры белков стало свидетелем значительного прогресса в недавнем прошлом благодаря достижениям в сворачивании новых белков с нуля с использованием достаточно точной оценки матрицы расстояний между остатками [1–4]. Матрица расстояний кодирует трехмерную (3D) структуру белка через информацию пространственной близости между остатками, которая может быть преобразована в физические ограничения, чтобы управлять процессом сворачивания ab initio с минимальным конформационным поиском [5,6].Следовательно, основанная на расстоянии фолдинг белков привлекла большое внимание, что послужило толчком для значительных исследовательских усилий [7–11]. Однако отсутствие специальной системы визуализации, которая может динамически фиксировать процесс складывания на основе расстояния, исключает возможность получения визуального понимания его природы. Популярные в настоящее время инструменты молекулярной визуализации, такие как PyMol и UCSF Chimera [12,13], обычно предоставляют только статическое изображение конформации свернутого белка, но не фиксируют процесс сворачивания.Последние графические интерфейсы, такие как PyRosetta Toolkit [14] и InteractiveROSETTA [15], используют динамические перспективы, но они созданы исключительно для пакета молекулярного моделирования ROSETTA [16], который в первую очередь полагается на фрагментный подход к сворачиванию белков. InteractiveROSETTA имеет множество сложных функций на основе ROSETTA, включая API-интерфейсы для включения различных ограничений расстояния. Тем не менее, автономный визуализатор, который предоставляет исследователям понимание складывания на основе расстояния, все еще отсутствует.Помимо инструментов визуализации, ориентированных на экспертов, интерактивный графический интерфейс Foldit Standalone [17] позволяет неспециалистам манипулировать структурами белков в контексте научно-популярной игры-открытия Foldit [18], которая сама основана на ROSETTA. и, следовательно, не на основе расстояния. Специализированный дистанционный визуальный симулятор сворачивания с простым в использовании интерфейсом не только предоставит исследователям центральную платформу для более глубокого изучения процесса сворачивания и получения важной информации, но также позволит легко реализовать последние технологические достижения в области сворачивания белков и молекулярного моделирования доступный для неспециалистов, но при этом точный с научной точки зрения.

Мы разработали совершенно новый автономный графический интерфейс под названием PolyFold для визуального моделирования процесса сворачивания белка на основе расстояния. PolyFold предоставляет несколько удобных элементов управления для запуска мощных алгоритмов оптимизации матрицы расстояний, включая градиентный спуск [19] и имитацию отжига [20,21], с настройкой по запросу и интерактивными манипуляциями. Благодаря визуализации в реальном времени интерактивной карты взаимодействия с плавным переходом цвета для захвата матрицы расстояний вместе с ее совместимой трехмерной конформацией, имеющей цветовую кодировку для выделения вторичной структурной геометрии, PolyFold позволяет динамически наблюдать за процессом складывания.Кроме того, интерактивная панель перемещения дает возможность структурно управлять молекулой. PolyFold не требует знания биохимии белков и обеспечивает легкодоступную платформу для объяснения процесса сворачивания белков на основе расстояния.

Характеристики PolyFold

Как показано на Рис. 1 , графический интерфейс PolyFold состоит из трех основных панелей: панели интерактивной карты взаимодействия для визуализации целевой матрицы расстояний (верхний треугольник) и текущей реализованной матрицы расстояний (нижний треугольник) с обновлениями в реальном времени динамическая структурная панель отображения, отображающая трехмерную конформацию молекулы белка, совместимую с текущей матрицей расстояний, и панель перемещения, которая позволяет пользователям интерактивно манипулировать молекулой.Ядро PolyFold реализовано на Java, а элементы управления графическим интерфейсом широко используют библиотеку приложений JavaFX. Код является кроссплатформенным, он создается и работает в macOS, Linux и Windows. Предварительно упакованные двоичные файлы также доступны для выполнения в режиме plug-and-play (см. Раздел 2 в S1 Text ).

Рис. 1. Репрезентативный сеанс складывания на основе расстояния PolyFold для аминоконцевого домена фермента I из Escherichia coli (PDB ID: 1zym) с отображением в реальном времени карты взаимодействия и ее совместимой трехмерной структуры.

Остаток 37 выбран для обработки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0243331.g001

PolyFold включает два оптимизатора для складывания на основе расстояния: градиентный спуск и имитацию отжига, первый работает в декартовом пространстве, а второй — в угловом пространстве. Пользователи могут запускать интерактивные версии обоих оптимизаторов, которые динамически обновляют отображение по мере запуска и могут быть отменены до завершения. Также возможны каскадные прогоны, которые либо чередуют, либо повторяют оптимизаторы, такие как повторяющийся градиентный спуск, используемый в AlphaFold [7].Параметры обоих оптимизаторов полностью настраиваются (см. Раздел 3.3 в S1 Text ). Стоит отметить, что механизм оптимизации PolyFold разработан для интерактивной визуализации оптимизации на основе расстояния в реальном времени, в отличие от моделирования молекулярной динамики (МД) на основе физики, которое часто используется для анализа промежуточных состояний или путей.

Пользовательские интерактивные манипуляции

PolyFold были специально реализованы для манипулирования молекулой в реальном времени.Пользователи могут управлять геометрией молекулы в режиме реального времени с одновременным обновлением карты взаимодействия в реальном времени, выбирая остаток и обновляя его псевдоплоские и двугранные углы, перетаскивая ползунки. Эта особенность может быть особенно полезной для многодоменных белков за счет сворачивания полноразмерной структуры с помощью оптимизации на основе расстояния и последующей корректировки относительной ориентации доменов путем манипулирования линкерами доменов. PolyFold также отслеживает историю измененных состояний для отмены, повторного выполнения, сохранения, загрузки и восстановления молекулы до развернутого расширенного состояния на различных этапах интерактивных манипуляций или встроенных оптимизаций.Структуры можно перемещать, вращать, масштабировать и автоматически масштабировать по мере необходимости (см. Разделы 3.1 и 3.2 в S1 Text ).

Сеанс PolyFold может быть запущен путем предоставления матрицы расстояний, аналогичной формату «остаток-остаток» (RR) в экспериментах по критической оценке прогнозирования структуры белка (CASP) [22-25] вместе с вторичными структурами (см. Раздел 4.1 в S1 Текст ). Промежуточные состояния сеанса могут быть сохранены в анонимных состояниях сохранения для быстрого вызова или сохранены в именованных состояниях сохранения для более длительных сеансов.Кроме того, структуры могут быть сохранены в формате Protein Data Bank (PDB) [26] и восстановлены в более позднем сеансе. Перед сохранением структуры PolyFold выполняет проверку геометрической хиральности с помощью вторичной структуры, используя эвристическую функцию стоимости для определения правильной хиральности как суммы по тетрапептидам в α-спиралях и β-листах [27]. Хотя PolyFold может работать с большими белками, в настоящее время поддерживаются структуры разумного размера (длина <500 остатков) для бесшовного рендеринга.

Пример использования

Чтобы проверить точность и надежность PolyFold для сворачивания на основе расстояния, мы изучаем сворачивание рибосомного белка 1ctfA длиной 68 остатков [28] из матриц почти нативных расстояний, а также матриц расстояний с шумом.Во всех случаях мы запускаем PolyFold, используя один прогон имитации отжига со случайным начальным значением 0, за которым следуют три повторных прогона градиентного спуска с параметрами PolyFold по умолчанию.

Сначала мы выполняем сворачивание на основе расстояния, загружая матрицу близких к естественному расстоянию в PolyFold в формате CASP RR после вычисления полов и потолков истинных расстояний между остатками целевого белка 1ctfA. То есть, матрица близких к исходному расстоянию, передаваемая в PolyFold, определяет расстояния в пределах 1Å от истинных действительных расстояний, таким образом моделируя сценарий реконструкции.Как показано на рис. , рис. 2, , PolyFold успешно реконструирует структуру целевого белка с очень высоким TM-баллом [29] 0,92, демонстрируя эффективность встроенных оптимизаторов PolyFold.

Рис. 2. Реконструкция на основе расстояния PolyFold для цели 1ctfA с матрицей расстояний, близкой к исходной.

Верхняя диагональ показывает матрицу расстояний между остатками, а нижняя диагональ показывает структурное наложение между предсказанной моделью PolyFold (в виде радуги) и экспериментальной структурой цели (серым цветом).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0243331.g002

Затем мы исследуем эффект подачи зашумленных матриц расстояний [30,31] в механизм структурной оптимизации PolyFold путем систематического введения гауссовского шума с нулевым средним, имеющего стандартный отклонения σ = 1, 2 и 4Å от истинной матрицы расстояний целевого белка 1ctfA. Это достигается путем вычисления сначала парных расстояний между остатками из почти родного файла PDB. Затем мы создаем пул пар вычетов (i, j), где | i – j | > 6.Затем мы либо равномерно случайным образом выбираем 50% пар, либо выбираем 100% пар из пула для изменения. Мы называем этот процент выбора «уровнем шума». Затем вычисленные расстояния, близкие к естественным, модифицируются гауссовым шумом с нулевым средним и заданным стандартным отклонением. Как показано на рис. , рис. 3 , мы видим, что оптимизации PolyFold достаточно устойчивы к шуму, предсказывая правильную кратность с оценкой TM> 0,5 [32] во всех случаях, кроме самого крайнего случая с уровнем шума 100% и стандартным отклонением. 4Å ( фильмов S1 – S6, ).Когда зашумленные матрицы расстояний с σ = 1Å загружаются в PolyFold, он достигает TM-оценок 0,89 и 0,86 для уровней шума 50% и 100% соответственно. Удвоив шум до σ = 2Å, PolyFold по-прежнему предсказывает правильные складки с TM-оценкой ≥ 0,6 как для 50%, так и для 100% уровней шума. Наконец, PolyFold предсказывает правильную складку с TM-оценкой 0,5, используя довольно зашумленную матрицу расстояний с σ = 4Å и уровнем шума 50%, демонстрируя свою надежность в складывании на основе расстояния при использовании зашумленных матриц расстояний.

Рис. 3. Сворачивание на основе расстояния PolyFold для целевого 1ctfA с зашумленными матрицами расстояний.

Верхняя диагональ показывает зашумленную матрицу расстояний между остатками путем введения гауссова шума с нулевым средним в матрицу истинных расстояний с различными стандартными отклонениями (σ) и уровнями шума. На нижней диагонали показано структурное наложение между предсказанной моделью PolyFold (в виде радуги) и исходной структурой цели (серым цветом). (A) Уровень шума 50% и σ = 1Å, (B) Уровень шума 100% и σ = 1Å.(C) Уровень шума 50% и σ = 2Å, (D) Уровень шума 100% и σ = 2Å. (E) Уровень шума 50% и σ = 4Å, (F) Уровень шума 100% и σ = 4Å.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0243331.g003

Сравнительный анализ

Хотя PolyFold в первую очередь представляет собой интерактивный визуальный симулятор фолдинга белков на основе расстояния, а не метод прогнозирования структуры, мы оцениваем эффективность прогнозного моделирования PolyFold, используя набор тестов из шести небольших белков длиной от 43 до 76 остатков, которые были предметом исследования. предыдущих исследований [33,34].Для прогнозного моделирования с использованием PolyFold мы прогнозируем вторичные структуры путем локального запуска SPIDER3 [35]. Затем мы передаем предсказанные вторичные структуры вместе с матрицами расстояний в PolyFold с различными разрешениями — от почти естественных до зашумленных и предсказанных карт. Во всех случаях мы используем два каскадных прогона оптимизации градиентного спуска PolyFold, оба для 65 000 итераций, причем первый прогон использует размер шага 0,005, а второй прогон — размер шага 0,0001. Оптимизированные структурные модели впоследствии сохраняются в формате PDB для оценки.Во-первых, мы загружаем матрицы близких расстояний в пределах 1Å от истинных действительных расстояний вместе с предсказанными вторичными структурами в PolyFold и оцениваем точность предсказанных моделей. Затем мы оцениваем прогностическую эффективность PolyFold с использованием зашумленных матриц расстояний. Мы следуем той же стратегии введения гауссовского шума с нулевым средним, как обсуждалось ранее, чтобы сгенерировать зашумленные матрицы расстояний для эталонного набора. Мы загружаем зашумленные матрицы расстояний со стандартными отклонениями σ = 1, 2 и 4Å при уровнях шума 50% и 100% вместе с предсказанными вторичными структурами в PolyFold и оцениваем эффективность складывания.Наконец, мы исследуем предсказательную способность PolyFold, когда в качестве входных данных используются предсказанные матрицы расстояний и предсказанные вторичные структуры. Для каждой белковой мишени в наборе тестов мы прогнозируем карты расстояний между остатками, загружая данные нескольких выравниваний последовательностей (MSA) [36] целевых белков в trRosetta [10], а затем предоставляем карты прогнозируемых расстояний вместе с прогнозируемыми вторичными структурами. в PolyFold для оценки точности предсказанных моделей. trRosetta [10] — это современный метод прогнозирования структуры белка, основанный на глубоком обучении, который прогнозирует расстояния и ориентацию между остатками (двугранные и плоские углы), которые впоследствии преобразуются в ограничения для создания трехмерных структур с использованием минимизации энергии.С точки зрения сворачивания и trRosetta, и PolyFold полагаются на оптимизацию на основе градиента. Однако фальцовка на основе trRosetta использует информацию о расстоянии и ориентации, тогда как PolyFold использует только информацию о расстоянии. Поэтому для справедливого сравнения производительности с PolyFold мы используем складывание на основе trRosetta, используя только карты прогнозируемых расстояний, но не информацию об ориентации. Мы запускаем складывание только по расстоянию на основе trRosetta локально, устанавливая параметр («-no-orient»), который использует те же карты расстояний, предсказанные trRosetta, предоставленные в PolyFold, хотя и без ориентации.Кроме того, мы сравниваем эффективность прогнозного моделирования PolyFold с двумя современными конвейерами прогнозирования структуры белков: I-TASSER [37,38] и Robetta [39]. Мы отправляем задания на сервер I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) после исключения гомологичных шаблонов с 30% отсечением идентичности последовательностей с целевым белком и собираем наиболее предсказуемую модель для каждый целевой белок. Мы отправляем задания на сервер прогнозирования структуры Robetta (https: //robetta.bakerlab.org /), выбрав вариант «только AB», чтобы использовать метод сборки фрагмента Rosetta для сворачивания ab initio [16] и собрать верхнюю предсказанную модель для каждого целевого белка. Следует отметить, что в отличие от прямого сравнения фальцовки на основе расстояния с использованием PolyFold и trRosetta, прямое сравнение между PolyFold и I-TASSER или Robetta нечестно, потому что I-TASSER и Robetta имеют явные преимущества в использовании шаблона. и / или информацию о фрагментах, а также другие структурные особенности, такие как доступность растворителя.Кроме того, как I-TASSER, так и серверы Robetta используют полноценный конвейер предсказания структуры, выполняя трудоемкую конформационную выборку для генерации большого пула структурных ложных целей с последующим оптимальным выбором ложных целей и уточнением всех элементов. Напротив, PolyFold не имеет таких преимуществ, поскольку он использует недорогую в вычислительном отношении оптимизацию матрицы расстояний в течение одного сеанса, работая с сингулярной структурой без доступа к другим структурным функциям, таким как шаблоны или фрагменты, и не выполняет полностью атомное уточнение.Тем не менее, сравнение PolyFold и I-TASSER или Robetta предлагает некоторые интересные выводы.

Таблица 1 сообщает о характеристиках прогнозного моделирования PolyFold с использованием матриц расстояний при различных разрешениях по сравнению с I-TASSER и Robetta, а также прямое сравнение между PolyFold и trRosetta только для расстояния, оба с использованием одного и того же прогнозируемого расстояния. матрицы. Используя предсказанные вторичные структуры и матрицы расстояний, близких к естественным, PolyFold достигает среднего TM-балла 0.73, что выше, чем у I-TASSER и Robetta со средними показателями TM 0,72 и 0,67 соответственно. Более того, диапазон точности PolyFold (максимальная оценка TM 0,96, минимальная оценка TM 0,49) лучше, чем у I-TASSER (максимальная оценка TM 0,9, минимальная оценка TM 0,42) и Robetta (максимальная оценка TM- оценка 0,82, минимальная оценка TM 0,42. Таким образом, прогнозное моделирование на основе PolyFold с использованием матриц расстояний, близких к исходным, обеспечивает лучшую производительность, чем I-TASSER и Robetta. в PolyFold средний балл TM становится 0.67, что соответствует среднему TM-баллу Робетты. По мере увеличения σ и уровней шума входных матриц расстояний средние TM-баллы неуклонно снижаются. Это ожидаемо, и это демонстрирует надежность механизма оптимизации PolyFold. Когда предсказанные вторичные структуры и предсказанные матрицы расстояний загружаются в PolyFold, он достигает среднего TM-балла 0,39, что лучше, чем trRosetta только для расстояния, имеющего средний TM-балл 0,35. Лучшая средняя производительность PolyFold по сравнению с trRosetta только на расстоянии подчеркивает эффективность оптимизации PolyFold на основе градиента.Интересно, что матрицы прогнозируемых расстояний приводят к лучшей средней точности результирующих структурных моделей в PolyFold, чем зашумленные матрицы расстояний с σ = 4Å с уровнем шума 50% и 100%; тогда как использование зашумленных матриц расстояний с σ = 2Å дает средний балл TM> 0,5 как для 50%, так и для 100% уровней шума, таким образом превосходя моделирование с прогнозируемыми матрицами расстояний. То есть качество прогнозируемых матриц расстояний, возможно, находится где-то посередине между качествами зашумленных матриц расстояний при σ = 2Å и σ = 4Å.Результаты показывают, что механизм оптимизации PolyFold чувствителен к незначительным изменениям качества входной матрицы расстояний и, следовательно, может быть подходящим для изучения влияния зашумленных и прогнозируемых матриц расстояний при моделировании белков, чтобы исследовать, какие части белка превышают или недостаточно сдержанный. Эти области матрицы расстояний затем можно было бы соответствующим образом изменить, чтобы улучшить характеристики прогнозного моделирования. Кроме того, полностью настраиваемый механизм оптимизации PolyFold позволяет пользователям экспериментировать, как различные параметры оптимизации, такие как размер шага градиентного спуска, могут повлиять на результирующие структурные модели в реальном времени.Это может помочь при моделировании гибких областей, таких как петли, которые могут быть недостаточно ограничены в матрице прогнозируемых расстояний. Таким образом, PolyFold надежен, универсален и практически полезен для прогнозного моделирования белков.

Таблица 1. Производительность прогнозного моделирования для набора данных эталонного теста с использованием PolyFold с прогнозируемыми вторичными структурами SPIDER3 и близкими к исходным, зашумленными и прогнозируемыми картами.

I-TASSER и Robetta ab-initio результаты моделирования, полученные путем отправки заданий непосредственно на их веб-серверы, а также результаты trRosetta только на расстоянии, полученные путем локального запуска с настройками параметров (‘—no-orient’) , также сообщается.

Оставьте комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *