Часы функциональные: Стильные и функциональные часы Smart Watch Q18 купить в Казани | Личные вещи

Содержание

Функциональные часы по доступной цене! — Блог


Мужские часы Weide Casual, купить которые Вы можете в нашем интернет магазине «Бест-Тайм», привлекают своей функциональностью и внешним видом. Эта модель обладает истинно мужским характером.


Дизайн и внешнее оформление


Внешний вид часов Weide Casual подчеркивает силу духа своего владельца, являясь отождествлением мужественности и практичности в деталях. Каждый элемент корпуса и браслета часов продуман до мелочей. Отлично сочетаясь между собой, компоненты аксессуара составляют гармоничное целое.


Метки времени, вставки на ободке корпуса и на браслете выполнены в одном стиле и цветовой гамме. Они дополняют и украшают строгий серебристый металл, из которого изготовлены часы.


Боковые кнопки управления функциями часов Weide Casual и заводная головка – являются продуманным элементом дизайна корпуса. Они также разных – серебристого и золотистого цветов.


Удобство использования


Особой «фишкой» часов Weide Casual является наличие двойного формата демонстрации времени.  За классическим стрелочным циферблатом скрывается отличная цифровая led-индикация. Для того, чтобы узнать время в очень темное время суток, достаточно нажать на одну из кнопок. Тогда на основном циферблате ярко загорятся цифры текущего времени. Сложно недооценить такую великолепную техническую особенность данной модели часов.


Кроме этого стрелки часов также могут демонстрировать время вечером благодаря специальному напылению на своей поверхности. Находясь на солнце или просто на дневном свете, они накапливают энергию и потом светятся в темное время суток.


Если Вы купите часы Weide Casual, вероятность потерять их с руки будет ничтожно мала. Благодаря застежке на браслете часов, которая полностью не раскрывается, они будут надежно  держаться на запястье. К тому же застежка оснащена механизмом дополнительной защиты. Это значит, что зацепившись за одежду, она случайным образом не раскроется.    


«Секретные» функции часов


Кроме основных функций демонстрации времени двумя способами, на электронном дисплее также можно посмотреть текущий месяц, день недели и дату. Они вызываются нажатием на кнопки, расположенные по бокам корпуса.


Приобретение часов Weide Casual в нашем интернет магазине станет для Вас отличным решением проблемы выбора надежных и качественных часов. Хороший японский кварцевый механизм, являющийся сердцем хронометра, прослужит достаточно долгое время. Единственной Вашей задачей будет лишь своевременная замена в нем элемента питания.  


Часы Weide Casual также могут стать отличным подарком мужчине, предпочитающему простоту в использовании, качество в деталях и универсальность в ношении. Для такого варианта вместе с изделием в нашем магазине можно заказать также подарочную коробочку. 

неплохие функциональные и стильные смарт-часы за $40

Ассортимент смарт-часов компании DT NO.1 пополнился несколькими достаточно интересными моделями, одна из которых – модель с номером модели DT70. Также эти часы можно встретить с названием  KK70, Gearvita DT70, LYKRY DT70 и т.д. Новинка имеет неплохой внешний вид, хорошие характеристики и ряд функций, о которых мы расскажем подробнее в обзоре.

Основные характеристики DT70 (KK70)

Дисплей 1,39 дюйма
Тип экрана IPS
Разрешение 454*454 пикселей
Процессор RTK8762D
Операционная система Фирменная прошивка
Датчики Оптический датчик пульса, акселерометр, датчик ЭКГ
Аккумулятор 280 мАч
Автономность 3 — 7 дней
Защита IP68
Размеры (без ремешка) 45*45*11,5 мм
Связь Bluetooth 5.0
Совместимость iOS / Android

Дизайн и комплектация

Поставляются часы в объемной коробке из плотного черного картона. На упаковке нет практически никакой информации о часах, не считая названия модели «SMART WATCH KK70» и названия производителя на дне коробки. Кстати, упаковка может отличаться, в зависимости от бренда, под которым часы продаются. Некоторые покупатели получают DT70 в небольшой прямоугольной коробке белого цвета.

Внутри упаковки сами часы, дополнительный силиконовый ремешок, зарядное устройство и короткое руководство пользователя на нескольких языках.

Часы доступны в черном или серебристом цвете. Можно выбрать вариант с металлическим браслетом, кожаным или силиконовым ремешком. Дополнительно все варианты комплектуются силиконовым ремешком черного цвета. Судя по обзорам, DT70, упакованные в белую коробку, дополнительным ремешком не комплектуются.

Наш экземпляр серебристого цвета с кожаным ремешком коричневого цвета. Кожа, конечно же, искусственная.

Корпус часов достаточно массивный. Его диаметр составляет 45 мм, толщина 11,5 мм. Ширина ремешка съемного ремешка – 22 мм. Что касается материалов корпуса, то здесь возникает путаница. Некоторые обзорщики утверждают, что он изготовлен из нержавеющей стали, другие, что из алюминия. На сайте производителя указано, что корпус алюминиевый, также упоминание данного металла можно найти на задней панели часов. Но, как по мне, материал больше похож на какой-то сплав, скорее всего сплав цинка.

Также на задней панели можно найти упоминание защиты часов от воды и пыли по стандарту IP68. Хотя данный класс защиты подразумевает, что устройство выдержит погружение под воду на непродолжительное время, производитель не рекомендуем в них купаться или плавать. Подробнее на официальном сайте https://www.dtnoi.com/product/dtno-i-dt70/.

Задняя панель NO.1 DT70 керамическая, что достаточно большая редкость для бюджетных смарт-часов. Такое решение позволило реализовать беспроводную зарядку, о которой более подробно в конце обзора.

На задней панели можно увидеть отверстие динамика, оптический датчик и пару электродов для снятия ЭКГ.

Несмотря на внушительные габариты, на руке часы смотрятся неплохо и не доставляют дискомфорта во время ношения. Так DT70 выглядят на руке:

Экран и циферблаты

Часы получили 1,39-дюймовый сенсорный дисплей. Это не AMOLED, но очень яркая и контрастная IPS матрица с высоким разрешением в 454*454 пикселей. Практически под любым углом и даже при самом ярком освещении информацию на экране видно замечательно. К сожалению, функции Always on Display (всегда на экране) нет. Также нет функции автоматической регулировки яркости ни в зависимости от окружающего освещения, ни регулировки по времени.

Особенно неприятно отсутствие автоматической регулировки яркости в ночное время. Подсветка очень яркая и ее включение во время сна может разбудить не только владельца, но и окружающих. Приходится вручную устанавливать минимальное значение (доступно 4 уровня), а также отключать в приложении активацию экрана поднятием запястья, что очень неудобно.

В памяти устройства я насчитал 21 вариант оформления циферблатов. Еще около 120 вариантов доступно в мобильном приложении. Также есть возможность настроить собственный вариант, установив свое фоновое изображение.

Управление и интерфейс

Управлять настройками и функциями смарт-часов можно с помощью свайпов по экрану и трех механических кнопок на правой стороне корпуса. Короткое нажатие верхней кнопки включает и выключает экран, долгим нажатием часы включаются/отключаются. Нижняя кнопка открывает меню спортивных режимов.

Центральная кнопка вращающаяся. Она отвечает за вызов меню функций (нажатие кнопки), а также с ее помощью можно переключать пункты меню и циферблаты. Основное меню имеет 3 вида оформления: 2 вида карусели и обычный список.

Изменить главный циферблат можно долгим нажатием на рабочем экране, вращением коронки на главном циферблате или через меню часов.

Свайпом по экрану вниз открывает шторку с информацией о состоянии подключения, уровне заряда аккумулятора, кнопками вызова QR-кода для загрузки приложения, настройки яркости экрана, собственному QR-коду и основным настройкам.

Свайпом вправо открывается шторка с уведомлениями, доступом к вызовам и иконки быстрого доступа к некоторым функциям. Свайп вверх – основное меню.

Жестом влево вызываются виджеты функций:

  • Активность за день
  • Пульс
  • Погода
  • ЭКГ

Еще один виджет можно добавить на свое усмотрение (сон, дыхательные упражнения, управление музыкой). Также можно удалить ненужные виджеты.

Основное меню состоит из таких пунктов:

  • Телефон
  • Сообщения
  • Контакты
  • История звонков
  • Активность
  • Тренировки
  • Пульс
  • ЭКГ
  • Музыка
  • Сон
  • Секундомер
  • Погода
  • Мой QR-код
  • Калькулятор
  • Найти телефон
  • Метеорологический прогноз
  • Тренировка дыхания
  • Стиль меню
  • Настройки (язык, переключение циферблатов, время подсветки экрана, интенсивность вибрации, пароль, сброс до заводских установок, подключение к смартфону по Bluetooth).

Подключение к телефону

Для сопряжения DT NO.1 DT70 (KK70) со смартфоном используется приложение WearPro. Оно доступно для загрузки из Play Маркет и из App Store.

Приложение WearPro появилось совсем недавно и, хотя уже успело получить несколько обновлений с исправлением «косяков», недостатков у него предостаточно. Это и «кривой» перевод и невысокая стабильность соединения, не самые удобные и подробные графики активности и т.д. Возможно, в будущем разработчики и устранят недочеты, но, пока есть как есть.

Интерфейс приложения разделен на 4 основные вкладки:

  1. Здоровье
  2. Тренировки
  3. Устройство
  4. Обо мне.

Во вкладке «Здоровье» есть виджеты активности за день (шаги, калории, расстояние), виджет сна и пульса.

В разделе «Тренировки» находится информация о занятиях спортом.

В меню «Устройство» находятся основные настройки часов:

  • Отправка циферблата. Загрузка дополнительных циферблатов в память часов.
  • Найти устройство. При нажатии кнопки часы будут вибрировать.
  • Камера. Управление затвором камеры смартфона нажатием кнопки часов.
  • Включение экрана поднятием запястья.
  • Уведомления о звонках.
  • Уведомления о СМС.
  • Уведомления приложений. Выбор приложений, от которых на часы будут приходить уведомления.
  • Мой QR-код. Меню добавления QR-кодов Alipay, WeChat и т.д.
  • Звонок по Bluetooth. Подключение DT70 к смартфону по Bluetooth для звонков.
  • Мониторинг пульса. Настройка автоматического круглосуточного измерения пульса с интервалом 10 – 60 минут.
  • ЭКГ-тест. Запуск измерения ЭКГ из приложения.
  • Частые контакты. Из этого меню можно синхронизировать контакты для набора с часов. Можно добавить до 20 контактов.
  • Еще. Настройка режима «Не беспокоить», будильники, напоминание размяться, напоминание о питье.
  • Обновление прошивки.
  • Отключение часов от приложения.

Последний раздел приложения WearPro – Обо мне. Здесь все просто – заполняется личная информация (рост, возраст, вес, пол), настраиваются единицы измерения и цели по количеству дневных шагов и продолжительности сна.

Функции DT NO.1 DT70

Как, наверное, уже понятно из описания настроек и интерфейса, основные функции смарт-часов DT70 следующие:

  • Подсчет шагов, калорий и пройденного расстояния
  • Измерение пульса в режиме реального времени и автоматический мониторинг
  • Отслеживание 7 спортивных режимов (бег, ходьба, велосипед, скакалка, баскетбол, бадминтон, футбол).
  • Снятие ЭКГ
  • Звонки по Bluetooth
  • Уведомления о звонках и сообщениях
  • Управление камерой и проигрывателем смартфона
  • Прогноз погоды
  • Отслеживание сна
  • Функция «Поиск телефона»
  • Будильник
  • Секундомер
  • Калькулятор
  • Метеорологический прогноз
  • Дыхательные упражнения
  • Массажер

На некоторых функциях остановлюсь более подробно.

Уведомления и звонки

В режиме телефона часы работают отлично. С часов можно сделать звонок, принять его или отклонить. Динамик и микрофон неплохие, и слышимость хорошая, и собеседник слышит замечательно.

При входящем звонке на экране часов показывается имя контакта или номер телефона, а также кнопка ответа или отклонения вызова.

При входящем уведомлении гаджет оповещает об этом вибрацией, а на экране показывается имя отправителя или название приложения. С большинством приложений часы работают более или менее корректно, но из Telegram и Viber уведомления не приходят, хотя они и включены в приложении.

Мониторинг активности

Акселерометр DT70 достаточно неплохо справляется с подсчетом шагов. В сравнении с Huawei Watch GT 2e разница по количеству пройденных шагов в среднем не больше 7 – 10 процентов. «Лишние» шаги DT70 не считает. Расстояние также примерно соответствует действительности, а вот израсходованных калорий DT70 показывает ровно в два раза больше.

Часы поддерживают мониторинг 7 спортивных режимов: бег, ходьба, велосипед, скакалка, баскетбол, бадминтон, футбол. Основное отличие всех режимов в названии, а данные фиксируются практически одни и те же: продолжительность, шаги, калории, расстояние, пульс. Для спортсменов этих данных будет недостаточно, так, только для общей информации. На скриншоте ниже пример отчета о тренировке:

Сон

Спать с часами такого размера на руке понравится не всем, но они могут автоматически фиксировать время засыпания и пробуждения, а также разделять сон на фазы. По сравнению со многими другими смарт-часами и фитнес-браслетами,  DT70 позволяет получить очень «скромный» отчет о сне. Только общая продолжительность, длительность легкого и глубокого сна. Нет ни общей оценки качества, ни рекомендаций по его улучшению.

Пульс и ЭКГ

Пульс девайс измеряет довольно точно, но только в спокойном состоянии. Во время тренировок увеличение пульса показывается с отставанием и большой погрешностью.

Что касается ЭКГ, то, как по мне, здесь эта функция не до конца реализована. Что-то часы измеряют примерно минуту, но в итоге появляется отчет в виде графика с изменением пульса. Никакой расшифровки или итогов измерения нет. Что можно понять из такого отчета, лично я не понимаю.

Массажер и дыхательные упражнения

При включении функции «Массажер» часы начинают непрерывно вибрировать, причем вибрация достаточно сильная. Правда, смысл этой функции до конца не понятен.

Есть функция «дыхательная гимнастика». В большинстве смарт-часов она идет в паре с измерением стресса, как способ снижения его уровня. Здесь же измерения стресса нет. Можно настроить скорость вдохов и выдохов, а также настроить продолжительность упражнения (1 – 3 минуты).

Погода и метеорологический прогноз

Устройство может показывать минимальную и максимальную температуру на текущий день, облачность, уровень ультрафиолета и давление воздуха. С какого сервера эти данные берутся, неизвестно, но они более или менее соответствуют действительности.

Автономность

За время автономной работы устройства отвечает аккумулятор емкостью 280 мАч. Производитель обещает 4-5 дней автономной работы при обычном использовании или 7-10 дней в режиме ожидания. По факту все зависит от интенсивности использования и настроек. С максимальной яркостью, уведомлениями, постоянным измерением пульса и небольшим количеством звонков через часы без зарядки DT70 у меня работают 2 – 3 дня.

Благодаря керамической задней крышке производителю удалось реализовать беспроводную зарядку. С ее помощью аккумулятор заряжается примерно за 2,5 – 3 часа. Но, стоит учитывать, что магнит у зарядной площадки очень слабый и при любом движении зарядка легко прерывается.

Есть и еще один «косяк». После того, как часы были поставлены на зарядку, даже через три часа на индикаторе было 40%. Но с таким уровнем часы без проблем работали три дня и только затем уровень заряда упал до 20%. Сначала была мысль о браке, но, посмотрев множество обзоров, стало понятно, что это массовый недостаток. Почти у всех в обзорах индикатор показывает 40% заряда, но никто на это не обратил внимания. Возможно, с будущими обновлениями этот недостаток устранят, но пока индикатор иногда «зависает».

Что в итоге?

Как и в случае с большинством бюджетных смарт-часов, у DT70 (KK70) есть как достоинства, так и недостатки.

Плюсы

  • Неплохое качество сборки и материалов
  • Большой и яркий экран
  • Множество дополнительных циферблатов
  • Дополнительный ремешок в комплекте
  • Отлично работает в режиме телефона
  • Удобная навигация и интерфейс
  • Беспроводная зарядка
  • Доступная цена

Минусы

  • При активном использовании зарядки хватает на 2 – 3 дня
  • «Сырое» приложение
  • Иногда после разрыва связи для повторного подключения приходится перезагружать телефон
  • Слабый магнит на зарядном устройстве
  • Нет функции измерения насыщения крови кислородом
  • Не приходят уведомления из Telegram и Viber
  • Нет регулировки яркости по расписанию
  • Уровень зарядки иногда «зависает» на 40%

В целом часы оставили неплохое впечатление. Они стильные, удобные и обладают большинством нужных функций. Но, даже за 40 долларов хотелось бы получить более «законченное» и доработанное устройство и его приложение-компаньон.

Где купить?

Приобрести DT70 можно на сайте компании NO.1 или в их официальном магазине на Алиэксппресс (вот здесь).

Анонс смарт-часов Meizu Watch: мощные, функциональные и премиальные

Meizu Watch предлагают AMOLED-дисплей, Snapdragon Wear 4100, быструю зарядку и поддержку устройств с HarmonyOS

Сегодня в Китае были представлены смарт-часы Meizu Watch, которые компания создавала с оглядкой на Apple Watch, и они стали первым носимым гаджетом компании, получившим прошивку Flyme for Watch. Продажи устройства стартуют 1 июня и оценили его в $236.

 

 

Корпус Meizu Watch выполнен из переработанного алюминия, задняя крышка керамическая и в качестве материала ремешка используется фторкаучук. Часы обладают 46-мм циферблатом, который прикрыт 2,5D-стеклом Gorilla Glass. Матрица AMOLED плотностью 326ppi, разрешение 448х368 точек и яркость 500 нит.

 

 

Аппаратная платформа Meizu Watch — Snapdragon Wear 4100 с 4 ядрами Cortex-A53 и графическим чипом Adreno 504. Оперативной памяти 1 Гб и постоянной 8 Гб. Питает часы аккумулятор емкостью 430 мАч и на одном заряде они проработают 33 часа. Зарядка магнитная и есть поддержка технологии быстрой зарядки, позволяющая зарядить батарейку на 33% всего за 15 минут, а на полную зарядку уйдет 45 минут. Реализовали режим экстренного энергосбережения, чтобы при заряде 10% хватило на 12 часов работы.

 

 

Среди особенностей Meizu Watch стоит выделить поддержку eSIM, модуль NFC, датчик измерения уровня кислорода в крови и пульсометр. Смарт-часы позволяют принимать звонки и уведомления, а также отправлять их без необходимости прибегать к помощи смартфона. Гаджет следит за физической активностью (11 спортивных режимов), позволяет удаленно управлять музыкой и камерой смартфона. Работать Meizu Watch могут со смартфонами на базе Android и HongmengOS (HarmonyOS).

 

Подписывайтесь на Andro News в Telegram, «ВКонтакте» и YouTube-канал.

 

Источник: gizchina

Автор:
Ирина Кошелева

Дата публикации:
31.05.2021

Поделиться статьей

Последние ролики на YouTube

Лучшие бюджетные умные часы

 

Как выбрать умные часы, которые не ударят по карману? В данном обзоре мы собрали наиболее привлекательные и функциональные бюджетные смарт-часы на рынке, чтобы сделать процесс выбора проще.

Выбор недорогих умных часов всегда был не простым. Рынок заняли производители вроде Amazfit и Xiaomi, которые научились делать функциональные смарт-часы при адекватной стоимости. И на это пришлось реагировать даже лидеру рынка — компании Apple, которой пришлось снижать стоимость Apple Watch Series 3.

Рынок недорогих носимых устройств продолжает активно наполняться новыми моделями разных производителей, и сделать выбор становится сложнее с каждый днем.

Мы собрали наиболее привлекательные, на наш взгляд, модели, обладающие не только недорогой ценой, но и неплохим функционалом, проработанным интерфейсом и адекватной точностью метрик. 

Amazfit GTS 2 Mini

 

Смарт-часы GTS 2 Mini в линейке производителя занимают место между Bip U Pro и GTS 2 / GTR 2.

В сравнении с Bip U Pro у GTS 2 Mini более стильный корпус, отличный AMOLED-дисплей, немного лучше материалы корпуса. И они меньше. А разница в цене незначительна.

Если сравнить Mini со старшей моделью GTS2, то единственным серьезным отличием можно считать отсутствие места для хранения музыкальных файлов, встроенного динамика и голосового помощника. Во время теста смарт-часов, отсутствие данных возможностей нас не рассторило. 

GTS2 Mini обладают 40-мм корпусом (42 мм у модели GTS 2), дисплей 1,55 дюйма. Разрешения экрана снижено до 306 x 354 пикселей, в сравнении со старшей моделью, но яркость осталась прежней — 450 Нит. Вес составляет всего 20 г, а также встроенные датчики GPS, SpO2, датчик сердечного ритма BioTracker 2.0. И это при 14 днях автономной работы. 

Мониторинг спорта включает в себя 60 профилей тренировок, взаимодействие с приложением Zepp, а также поддержку сторонних API, таких как Strava.

Весьма привлекательный вариант за свою стоимость.

Подробный обзор Amazfit GTS 2 Mini

Amazfit Bip U Pro

 

Это обновление модели Bip S, которое не повлекло за собой увеличение стоимости гаджета, что очень приятно. Значительно улучшен экран: теперь это 1,42 дюймовый дисплей (у Bip S дисплей диагональю 1,28 дюйма). Разрешение улучшили в два раза, до 320 х 302, хотя особенности TFT технологии экрана никуда не деть, и в значительно степени проигрывает технологии AMOLED. 

Bip U Pro получили встроенный датчик GPS, а также мониторинг уровня кислорода в крови (SpO2), мониторинг стресса и упражнения для дыхания. Показатели сердечного ритма отслеживаются с помощью модуля Amazfit BioTracker 2. 

Смарт-часы в состоянии отслеживать более 60 типов физической активности. 

Доступен голосовой помощник Alexa от Amazon, если удоно общаться с ассистентом на английском языке. 

Если GPS и голосовой ассистент не так важны, можно остановить свой выбор на модели Bip U, которая еще дешевле.

Считаем, что Amazfit Bip U Pro — это действительно мощные умные часы, обладающие функциями более дорогих Amazfit. Да, есть вопросы к качеству сборки и материалов, к точности данных о состоянии здоровья (не дотягивают до уровня Fitbit / Apple). Однако это устройство можно смело рекомендовать как разумную покупку для желающих сэкономить.

Huawei Watch Fit

 

Трекер на удивление приятно носить каждый день. Нам понравился 1,64-дюймовый AMOLED-экран 456 x 280, резкий и красочный. Есть встроенный GPS и более 100 спортивных профилей, а бег хорошо отслеживается с управляемыми программами тренировок и расширенными метриками, такими как аэробный тренировочный эффект, VO2 Max и время восстановления. 

Смарт-часы (или, все-таки, фитнес-трекер?) обладает влагозащитой до 50 м, оснащен функцией отслеживания плавания и контролем уровня насыщения крови кислородом (SpO2). По-прежнему возникают странные проблемы с программным обеспечением, а точность датчика сердечного ритма все еще невысока. Huawei уже вряд ли сделает свою операционку достаточно популярной массовой разработки сторонних приложений. Но это отличные умные часы, которые действительно будут полезны пользователю.

Подробный обзор Huawei Watch Fit

Realme Watch S

 

Вторые бюджетные умные часы Realme — гораздо более аккуратное и приятное глазу устройство, чем первые. Новинка получила круглый корпус и IPS дисплей. Сенсорный экран 1,3-дюйма  с разрешением 360 x 360, действительно выглядит как более дорогие аналоги, даже если внутри корпуса это не так.

Здесь нет GPS, и, несмотря на рейтинг влагозащиты IP68, гаджет не подходит для плавания. Это немного необычно даже в мире бюджетных умных часов. Несмотря на отсутствие GPS, доступно 16 спортивных профилей, в том числе бег, езда на велосипеде, настольный теннис, баскетбол, а также гребля в помещении и езда на велосипеде.

Оптический датчик частоты пульса отслеживает пульс в состоянии покоя и измеряет уровень сердцебиения во время тренировок. Смарт-часы также могут измерять содержание кислорода в крови с помощью датчика SpO2.

Батарея емкостью 390 мАч, по заявлению Realme, может обеспечить до 15 дней работы от одного заряда батареи.  Если сравнивать сс армией устройств Amazfit, это не особо впечатляет. По стоимости гаджет сравним с Bip U Pro.

Подробный обзор Realme Watch S

Huawei Watch GT 2e

 

GT 2 e — это более спортивная версия GT 2 с ярким и четким 1,39-дюймовым AMOLED-дисплеем. Доступно множество спортивных профилей, включая плавание (благодаря влагозащите до 5ATM), езду на велосипеде, отличный бег и достойное отслеживание сна.

Смарт-часы работают под управлением Lite OS, а не Google Wear OS, за счет чего достигается отличное время автономной работы при непрерывном использовании (14 дней). Доступен просмотр уведомлений с телефонов Android и iOS, возможность хранить музыку (только для Android). А еще Huawei теперь разрешили разработку сторонних приложений.

Huawei Watch GT2e действительно хороши для бегунов благодаря множеству показателей, четкому экрану, а также метрикам VO2 Max от Firstbeat и статистике восстановления. Единственным недостатком является то, что из-за отсутствия сторонних плагинов нельзя загружать данные в Strava, и нет других приложений для использования (пока).

Лучшее взаимодействие обеспечивается со смартфонами Android, чем с iPhone, и это отличный вариант для тех, кто ищет доступные спортивные умные часы.

Подробный обзор Huawei Watch GT 2e

Apple Watch Series 3

 

Когда в сентябре было объявлено о выходе нового поколения Apple Watch, версия Series 3 оказалась в ряду бюджетных смарт-часов.

Несмотря на это, Series 3 могут работать на том же программном обеспечении watchOS 7, что и Series 5, и по-прежнему есть GPS для отслеживания местоположения, 4G / LTE для поддержки сотовой связи, Apple Pay, отслеживание плавания и мониторинг сердечного ритма. 

Придется смириться с немного более квадратным дизайном, и отсутствием постоянно включенный дисплей или мониторинга ЭКГ, но все основные функции все еще здесь.

Fitbit Versa 2

 

Умные часы второго поколения обладают качественным отслеживанием активности и сна, как и следовало ожидать от Fitbit, с датчиком SpO2, который используется для мониторинга сна и показателей здоровья (для пользователей подписки Premium). В качестве умных часов пользователь получает доставку уведомлений, Fitbit Pay (не работает в РФ), а также набор приложений и циферблатов.

И неделя автономной работы, конечно же, не заслуживает внимания. Versa2 получили экран с разрешением 300 x 300 пикселей и яркостью 1000 нит. Учитывая все эти возможности, экран Versa 2 лучше увиден при ярком солнечном свете. Здесь нет GPS, и это большое упущение, которое было исправлено в следующем поколении, Versa 3. Но для обычных пользователей, которые хотят следить за своим здоровьем, это разумная покупка по доступной цене.

Подробный обзор Fitbit Versa 2

Amazfit GTR 2

 

GTR2, как и GTS 2, являются самыми дорогими в линейке стильных умных часов Amazfit, что в основном означает предложение лучших функций умных часов с классным дизайном.

Доступен выбор круглых корпусов из алюминия и нержавеющей стали с четким 1,39-дюймовым сенсорным дисплеем AMOLED, с разрешением 454 x 454 пикселей. Можно активировать функцию постоянно включенного дисплея (AOD). Уровень влагозащиты позволяет использовать смарт-часы для плавания, хоть они и не похожи на часы для фитнеса.

Возможна синхронизация с устройствами Android и iOS, предоставляя работу с уведомлениями, встроенный динамик для ответа на звонки по Bluetooth, автономный голосовой помощник и встроенный музыкальный проигрыватель. Хотя он не работает со сторонними сервисами потоковой передачи музыки.

Утройство может отслеживать шаги, непрерывно отслеживать частоту сердечных сокращений, контролировать сон и измерять содержание кислорода в крови по требованию. В наличии встроенный GPS и поддержка данных о тренировках в любимом приложении Strava. Несмотря на то, что время автономной работы заявляется от 14 до 38 дней, использование всех основных функций даст около недели работы от одного заряда. Если Fitbit Versa или Huawei Watch вам не по душе, стоит попробовать GTR 2.

Подробный обзор Amazfit GTR 2

Xiaomi Mi Watch

 

Mi Watch от Xiaomi оперативно появились на мировом рынке. Многофункциональные умные часы с серьезным упором на отслеживание занятий спортом стоили ожиданий.

Корпус пластиковый (из полиамида), 45-миллиметровый. Это легкие смарт-часы с высококачественным сенсорным AMOLED-экраном с диагональю 1,39 дюйма и разрешением 454 x 454 пикселей. Дисплей красивый и яркий. Влагозащита на уровне до 50 метров. Часы, совместимы с Android и iOS, используют собственную ОС Xiaomi, работают с доставкой уведомлений, могут менять циферблаты и даже оснащены голосовымпомощником Amazon Alexa (без поддержки русского языка).

Вместе с метриками отслеживания активности, присутствует встроенный GPS, датчик сердечного ритма, множество режимов тренировок. Метрики базируются на алгоритмах Firstbeat, принадлежащих Garmin, и предлагают данный о тренировочном эффекте и понимание восстановления организма, а также функцию,  аналогичную метрике Battery Body у Garmin. Возможно, устройству немного не хватает более точного спортивного отслеживания, которое присутствует на Huawei Watch GT 2e, но в Mi Watch есть много положительных моментов. Смарт-часы хорошо выглядят, предлагают хорошее сочетание функций и могут работать в течение нескольких недель от одного заряда.

Подробный обзор Xiami Mi Watch

Amazfit Neo

 

Amazfit Neo нельзя называть умными часами в привычном нам смысле. Это, скорее гибридные часы, выполненные в ретро-стиле, которые обладают некоторым количеством смарт-функций.

Легкий пластиковый корпус диаметром 40 мм, 1,2-дюймовый черно-белый дисплей STN, управляемый четырьмя физическими кнопками. Этот дисплей разделен на секторы, чтобы отображать данные о частоте пульса, прогнозе погоды и сигнализировать, когда на сопряженном телефоне появляется уведомление. 

Neo отслеживают шаги и сон, имеют датчик движения для мониторинга бега, ходьбы и езды на велосипеде. Это базовые метрики отслеживания активности, но они работают на удивление хорошо. Если вам нравится идея простых часов оригинальнного дизайна, оформленных в стиле олдскул, стоит рассмотреть недорогие Amazfit Neo внимательнее.

Подробный обзор Amazfit Neo

Источник: wear-gadget

_________________

 — присоединяйся к нам на Facebook

 — Наш канал в Telegram

 — мы в Instagram

Функциональные

Все производители21 векACAhuraAlberti LivioAlessandro ZucconiAlessiAngladaAntartideeARMArte CasaArtHouseAsiaTidesASM PackagingAurum-Crystal SROBaihui rattan funitureBarbieBelVaseBernadotteBest Home KitchenBlack + BlumBohemia CrystalBristolBRISWILDBruno CostenaroButterflyCampanellaCarneol KftCattinCearcoCeramiche bruno costenaro & c sncCeramiche d’arte flCeramiche d’Arte OrgiaCeramiche StellaCeramiche TreaCeramiche VivaCesky porcelan asCevik group srlChinelliChuggingtonCose Belle Cose RareCredanCredansaCrystalexCurverDalian hantaiDeco GlassDecorDedaloDella ValleDeltaDemDemetraDenix SADiamantini DomeniconiDisneyDomaniDonartDSVEgiziaEichholtzENSEvisF lli CapanniFabbroFaiancas artisticas bordallo pinheiroFarbelFengxiFerraroFLO gardensFranco & CoG & CGammaGloriaGloria GardenGoebelGranceGreat WallGreenHouseGuanghou xincleGuangzhou weihongHangzhou jindingHankoHebei grindiing wheelHello KittyHinz KunstHong Kong po leeHostyleHuajing plastic flower factoryImaImariIncantesimo DesignIngroflorItalia CorniciIzaioJardin D’eteJean BaptisteKepo TradeKodomoKrosnienskie huty szkla «krosno» saKwestorL’ObjetLa BalestraLa GeerLa Murrina MuranoLa Vesuviana BergerLamartLamelaLanzarin CeramicheLarangeLCSLe Monde CadeauxLeanderLegnoartLinea ArgentiLinea del TempoLishengLuce & RegaloLuminarcMagleodMaidoonMallonyMarmitonMarvelMatsJonassonMayer & BochMe-shokMedio EvоMEI XI GREETINGSMo WaMolentoMonte ChristmasMoritaMorita & CoMustardNapoleonNew ShineNicolina della valleNikaNika-SportNingboNouvelleNuova CerOlimpus BrassOlmecsOnlitopOrgiaOttavianiParastonePasabahce ТурцияPaterraPavonePeltrosilPO SelectedPolystarPorcelain Manufacturing FactoryPotockaPslQualyRattan funitureRCRRichmondRoyal CrownS AngeloSabadinSameSame DecorazioneSan MarcoSDJSea PowerSealmarkSebino ArteSeishinSheffieldShuaiSil-ka bvSogaSpykerStilarsSuck UkSun Ergysv di sabadin vittorio & c sncSwarovski ElementsT-weidTaizhou classic hardwareTalent FareastTechnoThunTiffani BoutiqueTM OUCAITM xinyaTom’s companyTop FineUmbraUnicorn StudioUnionVanboVeroneseVeronese EleganceVidrios San MiguelVironVirtusVogueWAH TAK MANUFACTORINGWalther-GlasWeimar PorzellanWhite CristalWinWinxWoodmaxWuHan Aishang Mei Packaging Prpducts CO, LtdXinGlinXinyaYoudZENZAZoffoliАльпинистикАльтернативаАромат ОгняВДКВегаВикторияДельфинДэмиИнстарКерамика ГлазовКОТЭЛенд АртМ-ПластикаМаксисветМаша и МедведьМегапластМир поздравленийНеманНовое времяОбразПапа КарлоПластишкаПолесьеПолимербытСалютСеверный СветСемьяСентябревъСмурфикиСоняСтартСтеклярусСтрана КарнавалияУкрсоюзимпексФеяХохломаШкола талантовЭвисЭкорамбусЭНСЭРА

Спортивные ручные часы: функциональные возможности

Многие люди сегодня при спортивных тренировках и прочих физических нагрузках отдают предпочтение спортивным часам. Ведь с их помощью можно не только смотреть время, но и поддерживать хорошую физическую форму благодаря дополнительному функционалу. Спортивные наручные часы созданы специально для профессиональных спортсменов и людей, которые придерживаются активного образа жизни. Кроме широких возможностей данные изделия готовы справиться с любыми нагрузками.

В онлайн-магазине «Анкер» представлены классические хронометры с влагостойкими и ударопрочными корпусами, а также и умная электроника для постоянного контроля физического состояния. В каталоге https://www.ankershop.ru/naruchnye/filter/style_watch-sportivnye/ можно найти часы для любых спортивных занятий. На каждое приобретенное изделие предусмотрена гарантия от производителя. Присутствует бесплатная доставка в пределах СПб или самовывоз. Продукцию реализует ООО «Анкер +» (ИНН 7814224549; ОГРН 1157847161922). Адрес: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Чугунная д. 14, территория завода им. Карла Либкнехта.

Дополнительные функции спортивных часов

Среди многочисленных вариантов присутствует разделение на мужские и женские модели. Как правило, они изготавливаются из специальных сплавов, способных справиться с серьезными нагрузками, включая суровые условия эксплуатации. К дополнительному функционалу спортивных часов можно отнести:

Измеритель пульса. При каждой тренировке нужно следить за показателями пульса. Функция позволяет определить степень готовности человека к продолжению занятий и поведает о возможностях организма;

Встроенный gps. Благодаря данной функции легко отследить маршрут тренировок и пройденный километраж. Как правило, такую возможность оценят спортсмены, проводящие тренировки на воздухе;

Влагозащита. Крайне важная функция для спортивных часов. Спортсмен может не переживать о том, что во время занятий попадет под дождь. Ведь его часы успешно справятся с такими сложностями. К тому же существуют модели с влагозащитой, позволяющие находиться в воде, например, в бассейне. Желательно уточнить это в инструкции или у продавца.

Правильно подобранные спортивные часы минимизируют опасность для здоровья при тренировках. Они станут более безопасными и эффективными.

На правах рекламы

Оценка текста

Стильные, недорогие и функциональные смарт-часы: обзор Canyon Oregano (cns-sw81)

«<b>**Hello World</b>»),друзья.**
****Сегодня ко мне на стол попали спортивные смарт-часы от компанииCanyon, а именно модель Oregano(cns-sw81).

Комплектация

Поставляются часы в красивой упаковке, выполненной вполне качественно, как со стороны материалов, так и со стороны полиграфии.

Внутри нас ожидают сами часы, сразу с установленным спортивным ремешком, второй классический ремешок, зарядка, руководство пользователя.

Ремешки
Ремешки один из самых важных элементов в любых часах, браслетах и прочем, ведь именно они постоянно контактируют с вашей кожей, а также именно они подчеркивают общий стиль аксессуара.

В данном случае мы имеем очень интересный набор ремешков прямо с завода. Первый, что показан и на упаковке, и на всех картинках в интернет-магазинах, спортивный двухцветный (белый-чёрный, серый-зелёный и серый-красный, в зависимости от купленной модели). Он выполнен из гипоаллергенного силикона, вполне приятного на ощупь и без видимых косяков. Отлит качественно: нет заусенцев, каких-то разводов, как зачастую у плохих ремешков, все отверстия и вырезы ровные. За счёт этих отверстий с цветовой окантовкой часы смотрятся спортивными, более агрессивными и брутальными. Помимо этого есть ещё и классический одноцветный ремешок, в котором нет каких-то резких и вызывающих элементов отделки, строгий и стильный.
Несмотря на такую огромную разницу в ремешках, часы хорошо смотрятся с любым из них, дизайн выполнен так, что какой бы ремешок не повесить смотреться будет как заводской.
Также надо отметить удобный механизм снятия и установки тех самых комплектных ремешков; у основания есть маленькие выступы, которые обеспечивают лёгкость установки.

Застежки на обоих ремешках одинаковые: металлические, с небольшой надписью Canyon.
Ширина ремешков стандартная: 22 мм.

Дизайн и корпус
Часы выполнены в классическом форм-факторе, толщина корпуса 12 мм, диаметр 43 мм (33 из которых занимает дисплей с IPS матрицей), материалы пластик и металл
В моем случае корпус окрашен в красивый серебристый цвет, в двух остальных моделях корпус красится в матовый темно-серый цвет.
По правую сторону расположена единственная механическая кнопка в данном девайсе, которая отвечает за возврат на домашний экран.
На нижней стороне часов мы можем увидеть оптический сенсор, а также контакты для usb подключения и зарядки.
В целом, рассказывать в подробностях про дизайн не вижу смысла, ибо на вкус и цвет все фломастеры разные. Просто приложу несколько фото со всех сторон, а красиво это, стильно или нет решать каждому. Могу сказать лишь что мне эти часы нравятся.
Нужно отметить защиту часов от воды и пыли по стандарту ip68, что дает полную защиту от пыли и работоспособность при попадании в воду и погружении на глубину до 1 метра и длительностью до получаса. Этого вполне хватит, чтобы поплавать в бассейне, принять с часами ванну (если это вам нужно) и прочее. Главное не забывайте, что во время попадания влаги на часы и тем более при погружение в воду строго настрого нельзя нажимать на кнопку. Да, она тоже защищена и по идее не должна пропускать воду, но поверьте моему опыту и не подвергайте устройство лишним угрозам, ведь кнопка самое уязвимое в этом плане место.

Дисплей

Тут установлен 1.3 дюймовый ( 3.3 см) дисплей, с круглой IPS матрицей разрешением 240 на 240 пикселей и встроенным тачем.
На моё удивление, экран оказался очень ярким и качественным за свои деньги, уровень подсветки имеет достаточно большой диапазон и настраивается в меню настроек на самих часах. На минимальной яркости дисплей не мерцает, в тёмное время суток не режет глаза и даже проснувшись посреди ночи можно с комфортом смотреть на них. На максимальной же яркости дисплей виден даже на ярком солнце. В то время, когда я на дисплее своего, далеко не худшего по дисплею, смартфона (oneplus 5t) еле-еле могу различить текст и яркие изображения, на экране часов вполне спокойно можно увидеть и уведомления, и погоду, и часы.
Из минусов отмечу: большие рамки вокруг дисплея. Понятное дело, что за цену до 5К вообще не встретить хороших новых смарт-часов с круглым дисплеем и тонкими рамками (а если такие есть напишите в комментариях, мне будет интересно посмотреть) но факт остаётся фактом.
Функциональность
По набору фунцций в этих часах все вполне стандартно. Измерение пульса, счётчик шагов, подсчёт сожженных калорий и пройденного расстояния, показ уведомлений, режимы для тренировок, с возможностью выбора одного вида спорта из большого списка, управление музыкой на смартфоне, отслеживание сна и показ погоды. Работают часы с фирменным приложением Canyon Life. Многим хватит и просто этой информации, но я немного расскажу обо всех этих функциях.
Измерение пульсатут работает вполне качественно и правильно, обеспечивает это оптический сенсор на нижней стороне устройства. Имеется шкала состояния, что полезно для быстрого отслеживания, а также выводится цифровое значение.
Счётчик шаговработает за счёт встроенного акселерометра. Точно или нет он считает количество шагов я досконально проверить, увы, не могу. Но, судя по ощущениям и пройденному расстоянию, считает он их верно. Фальшивых срабатываний (при тряске рукой, нарезке чего либо ножом и прочего, как у дешёвых часов) нет. Данные о шагах на дисплее обновляются раз в минуту или около того, в приложении при синхронизации или ручном обновлении данных.
Подсчёт сожженных калорийосуществляется после настройки вашего профиля в приложении. Учитываются по стандарту: вес, рост, возраст и пол. В подсчёте калорий я далеко не специалист, поэтому проверить правильность не могу. Но, в любом случае, не стоит полностью доверять подобным данным в любых смарт часах и браслетах. Цифры, что они рассчитывают, всегда примерные и не более.
Подсчёт пройденного расстоянияопределяется тут за счёт количества шагов и, насколько я понял, GPS телефона, ибо во время ходьбы приложения Canyon Life запрашивал у GPS данные о местоположение устройства. Как бы то ни было, считает расстояние устройство точно. Проведя пару тестов, я получил следующие результаты:
По факту 2.4 км, по GPS 2.4 км, по часам 2.3 км.
Тренировкитут имеются нескольких типов:

  • Прогулка
  • Бег
  • Велосипед
  • Беговая дорожка
  • Туризм
  • Плавание

Работают они примерно так же, как и в известных всем MiBand’ах 2-3 поколений. Точность неплохая и любителям фитнеса должно понравиться.
Отслеживание снаработает благодаря измерениям пульса и общей активности. По этой функции хорошо работают почти все часы, что у меня были в использовании, и тут также все работает хорошо. Единственное, что меня смутило: первые два дня после начала использования часов показатели были нереальными: то 1 час сна за целую ночь, то 40 часов за сутки. Однако, спустя как раз-таки эти два дня, все само собой устаканилось и показатели пришли в норму. Видимо, часы калибруются, либо же это был просто баг.
В плане показателей: мы получаем данные о фазах глубокого и лёгкого сна, времени начала и окончания сна, моментах когда мы посыпались и пульсе во время сна. К слову о пульсе в приложении можно настроить автоматическое измерение пульса через определённое количество времени.
Показ погодытут работает по стандарту, беря информацию со смартфона. Тот же самый виджет, что вы обычно видите на рабочем столе вашего телефона, просто на экранчике часов. Удобная и простая функция с неплохим визуальным исполнением.
Управление музыкойтут совсем простое, но есть. В приложении можно настроить определенный плеер с музыкой, либо автоматически управлять активным (запущенным). Можно перемотать трек, поставить на паузу и включить воспроизведение. Название трека не выводится
Самое важное и интересующие лично меня, да и многих, в этих часах —

Уведомления

Тут очень удобная настройка через приложение. По умолчанию часы подхватывают абсолютно любые уведомления и информируют вас. Если вы не хотите получать какие-то из них (как в моем случае уведомления от включения клавиатуры SwiftKey) то можно просто выключить уведомления от любого приложения. Важное замечание: чтобы появилась возможность отключить уведомления от какого-то конкретного приложения, часы должны сперва получить как минимум одно уведомление этого приложения.
Также имеется возможность читать сообщения и текст уведомления на самих часах, всё сохраняются в память, пока вы не прочитаете. Открыть меню уведомлений можно, сделав свайп по часам вправо. Отвечать на сообщения нельзя. Поддержка кириллицы есть. Есть функция не беспокоить, где можно выставить временной промежуток, когда часы не будут вибрировать при получении уведомления.
Надо также отметить, что часы имеют несколько разных и интересных циферблатов. Они меняются долгим нажатием на главный экран и свайпами вверх / вниз._Самим создавать их нельзя,но из имеющихся можно вполне выбрать подходящий лично вам.
Личные впечатления
Часы Oregano (cns-sw81) стали для меня каким-то открытием среди бюджетного сегмента умных часов. Сколько я уже перепробовал дешёвых моделей, и никто так и не смог превзойти мой любимый MiBand, кроме этих часов. За +- такую же стоимость эти часы имеют, на мой личный взгляд, куда более стильный внешний вид, больший и более яркий дисплей, а также более гибкую настройку уведомлений.
Конечно, есть и некоторые минусы устройства, такие как ограниченное количество циферблатов, не очень красивые шрифты и толстые рамки дисплея. Но
Мне одним словом понравились Canyon Oregano и я буду ими с удовольствием пользоваться в дальнейшем. И поэтому, если у Вас возникнут какие-то вопросы по часам, или я что то упустил в обзоре и Вам это нужно узнать пишите мне в личку или в комментариях. Я с радостью постараюсь ответить на ваши вопросы, по необходимости сделать дополнительные фотографии и прочее.
На этом у меня все. Огромное спасибо за прочтение, если у Вас есть объективная критика по обзору пишите ее в комментарии (я буду рад выслушать советы и улучшить свои обзоры)._Всем до встречи, всем пока!

границ | Функциональных часов в основных утренних и вечерних нейронах D. melanogaster недостаточно для двигательной активности дикого типа при изменении продолжительности дня

Введение

Эндогенные часы с периодом около 24 часов контролируют циркадные ритмы. Они увлекаются 24-часовыми земными циклами через внешние Zeitgebers, самым сильным из которых является свет. Поскольку активность должна происходить в наиболее благоприятное время дня, ритм отдыха и активности является одним из наиболее строго контролируемых часов поведения.В естественных условиях многие виды животных демонстрируют бимодальные профили активности отдыха и активности с выраженными утренними (M) и вечерними (E) приступами активности и низкой активностью в середине дня или ночи (Aschoff, 1966; Saunders, 2002; Dunlap et al. ., 2004). В долгие летние дни активность М проявляется раньше, а активность Е — позже, что помогает животным избегать полуденной жары, проявляя активность в основном утром и вечером. Такая адаптация особенно важна для мелких насекомых, таких как плодовые мушки, которым угрожает высыхание (Hamblen-Coyle et al., 1992; Majercak et al., 1999; Bywalez et al., 2012). Такое поведение наблюдается также в лаборатории при циклах свет-темнота (LD), но постоянные температуры показывают, что свет является основным сигналом, который вызывает эти изменения (Rieger et al., 2003, 2007, 2012; Shafer et al., 2004; Menegazzi et al. al., 2017; Schlichting et al., 2019b).

Давняя модель двух осцилляторов Питтендрига и Даана (1976), первоначально разработанная для млекопитающих, объясняет описанные сезонные адаптации, предполагая, что M-осциллятор сокращает его период, а E-осциллятор удлиняет его период при воздействии света на некоторое время. продленное время.Клеточная основа двух осцилляторов была впервые описана у плодовой мушки: осцилляторы M и E расположены в разных группах нейронов циркадных часов — так называемых нейронах M и E (Grima et al., 2004; Stoleru et al. , 2004; Rieger et al., 2006).

Мозговые часы Drosophila состоят из ~ 150 нейронов, которые экспрессируют белок PERIOD (PER), и разделены на различные кластеры латеральных и дорсальных нейронов (LN и DN) (Рисунок 1). Все нейроны часов образуют взаимосвязанную нейронную сеть, которая была частично морфологически и функционально расчленена (Rieger et al., 2006; Shafer et al., 2006; Helfrich-Förster et al., 2007; Яо и Шафер, 2014; Schubert et al., 2018).

Рис. 1. Схематическое изображение различных нейронов часов в мозге Drosophila . Правое полушарие мозга изображает традиционное деление в разных нейронах часов, включая их классификацию на утренние (M) и вечерние (E) нейроны в красноватых и голубоватых тонах соответственно. Тактовые нейроны, которые нельзя однозначно отнести к M или E нейронам, показаны серым цветом.Обратите внимание, что DN 1 p состоят из смеси нейронов M и E. Левое полушарие более подробно отображает нейроны M и E и указывает, в каких конкретных нейронах мы спасли PER в на 0 мутантов (зеленая кромка). Из-за ограниченного количества драйверов gal4 мы не всегда могли ограничить PER только M- или E-нейронами. Например, наш драйвер M-DN ( Clk4.1M-gal4 ) включал также ∼2 DN 1 p , которые принадлежат E-DN. Обратите внимание, что мы сгруппировали M- и E-DN в левом полушарии, чтобы указать на экспрессию Clk4.Линия драйвера 1M-gal4 . В случае M-LN только s-LN v являются настоящими M-генераторами, но с помощью драйвера Pdf-gal4 мы спасли PER также в l-LN v . В случае E-LN мы спасли PER в sNPF-положительных (E1) и ITP-положительных (E2) нейронах (с использованием драйвера PDF-gal80 Mai179-gal4 ). Криптохром (CRY) -отрицательные нейроны (E3) не включены.

Как определено в исходной работе, нейроны M состоят из вентральной группы нейронов боковых часов — четырех PDF-положительных малых вентральных боковых нейронов (s-LN v ), тогда как клетки E состоят из дорсальной группы нейронов. LN, LN d (Grima et al., 2004; Столеру и др., 2004). Более поздние исследования показали, что так называемый 5-й s-LN v также ведет себя как E-осциллятор, тогда как только три из шести LN d удлиняют свой период в ответ на свет и, таким образом, работают как настоящие E-осцилляторы (Rieger et al. ., 2006). Эти три E-LN d , скорее всего, идентичны трем клеткам LN d , экспрессирующим криптохром (CRY) (Picot et al., 2007). Недавняя работа показала, что три CRY-положительных E-LN d могут быть далее разделены на два коротких нейропептида F (s-NPF) -экспрессирующих нейронов и одну клетку, экспрессирующую пептид-переносчик ионов (ITP) (Рисунок 1; Johard et al., 2009). Самое интересное, что ITP также присутствует в 5-м s-LN v , и эта клетка оказалась морфологически очень похожей на ITP-положительную клетку E-LN d , а не на PDF-положительную M s-LN. v , что позволяет предположить, что 5-й s-LN v принадлежит нейронам E-LN d (Schubert et al., 2018). Даже функционально два ITP-положительных E-нейрона тесно связаны (Yao and Shafer, 2014). Поэтому, чтобы избежать путаницы с нейронами LN v M, мы предложили называть 5-й s-LN v просто 5-м LN (см. Рисунок 1).Как показано на рисунке 1, Яо и Шафер (2014) классифицировали клетки E на три группы: E1, E2 и E3. E1 соответствует s-NPF-положительному E-LN, E2 соответствует ITP-экспрессирующему E-LN, а E3 соответствует CRY-отрицательному E-LN (рисунок 1). В зависимости от условий окружающей среды три группы E-LN, по-видимому, ведут себя по-разному (Rieger et al., 2009; Yoshii et al., 2012; Yao and Shafer, 2014). Есть также указания на то, что дорсальные нейроны ∼15 DN 1 p состоят из осцилляторов M и E.Половина из них экспрессируют CRY, и простейшая точка зрения состоит в том, что CRY-отрицательные DN 1 p являются E-нейронами, а CRY-положительные DN 1 p являются M-нейронами (Murad et al., 2007; Zhang Y . et al., 2010; Yoshii et al., 2012). Далее мы называем эти нейроны E-DN и M-DN соответственно (рисунок 1).

В соответствии с моделью с двумя осцилляторами, нейроны M и E Drosophila по-разному реагируют на свет, причем M-клетки сокращают свой период, а некоторые E-клетки удлиняют свой период, когда мухи подвергаются постоянному освещению (Rieger et al., 2006; Yoshii et al., 2012). M-нейроны продвигают свою фазу в циклах тусклого постоянного света и светлого лунного света, тогда как E-нейроны задерживают свою фазу, тем самым увеличивая время между пиками активности M и E (Bachleitner et al., 2007).

Чтобы понять вклад различных нейронов часов в ритмическое поведение, был сгенерирован трансген UAS- с периодом , чтобы спасти на экспрессию с помощью конкретных gal4-драйверов в подмножествах нейронов M или E из . на 0 мутантные мухи (Grima et al., 2004). Как и ожидалось, эти мухи показывают различия во внешнем виде приступов активности M и E при записи в циклах LD с 12 часами света и 12 часами темноты (LD 12:12) (Grima et al., 2004; Picot et al., 2007; Zhang L. et al., 2010; Zhang Y. et al., 2010). Тем не менее до сих пор активность этих мух при разных фотопериодах не регистрировалась. Если исходная модель двух осцилляторов Питтендрайга-Даана действительна и осцилляторы M и E управляют активностью M и E автономно, утренняя активность мух с работающими осцилляторами M должна отслеживать включение света даже при отсутствии осцилляторов E. .И наоборот, вечерняя активность мух с работающими E-осцилляторами должна отслеживать выключение света даже в отсутствие M-осцилляторов. Здесь мы проверили эту гипотезу и обнаружили, что ситуация более сложная. Наши результаты согласуются с выводами нескольких других групп, которые по-разному манипулировали молекулярными часами в осцилляторах M и E (Picot et al., 2007; Stoleru et al., 2007; Zhang L. et al., 2010; Zhang Y. et al. 2010; Guo et al., 2014, 2016, 2018; Chatterjee et al., 2018; Schlichting et al., 2019b). В конце концов, мы показываем, что исходная модель осцилляторов M и E слишком проста, чтобы объяснить все выводы.

Материалы и методы

Штаммы мух

Чтобы ограничить экспрессию PER определенными нейронами часов M или E, мы начали с аритмичных на 0 мутантов и спасли PER с помощью системы UAS-Gal4 в подмножествах нейронов часов, как это было сделано ранее (Grima et al. , 2004; Picot et al., 2007; Zhang L. et al., 2010; Zhang Y. et al., 2010).Нейроны, которыми окончательно ограничивается PER, показаны на рисунке 1. Далее мы опишем используемые линии и скрещивания, которые дали экспериментальных и контрольных животных.

Pdf-gal4 / + летает, Mai179-gal4 / + летает, tim-gal4 / + летает, Clk4.1 M-gal4 летает, на 0 ; uas-per16 и Pdf-gal80 были описаны ранее (Renn et al., 1999; Kaneko and Hall, 2000; Siegmund and Korge, 2001; Grima et al., 2004; Столеру и др., 2004; Zhang L. et al., 2010).

Чтобы получить мух с PER только в клетках M-LN, мы скрестили самку по 0 ; uas-per16 от до самца Pdf-gal4 / + вылетает и отбирает потомство самцов для получения на 0 ; Pdf-gal4 / +; грн-пер16 / + летает. Чтобы получить мух с PER в большинстве LN (мух M- и E-LN), мы скрестили самку на 0 ; uas-per16 с самцом мух Mai179-gal4 / + и получили самцов на . 0 ; Mai179-gal4 / +; uas-per16 / + летает.Мы также создали конюшню на 0 ; Mai179-gal4 ; uas-per16 , который был скрещен со штаммом Pdf-gal80 для получения w per 0 ; Mai179-gal4 / Pdf-gal80; uas-per16 / + самцы, которые экспрессируют PER только в E-LN. Эти мухи экспрессируют PER в sNPF-позитивных и ITP-позитивных E-LN (клетках E1 и E2) (Yao and Shafer, 2014; Schubert et al., 2018). Самцов мух, экспрессирующих PER в 8–10 клетках DN 1 p , получали путем скрещивания самцов Clk4.1 муха M-gal4 с самкой на 0 ; uas-per16 летает. Генотип этих мух — на 0 ; Clk4.1 M-gal4 / uas-per16 . Эти мухи экспрессируют PER во всех CRY-положительных клетках DN 1 p , которые рассматриваются как М-клетки (Yoshii et al., 2012). Поэтому для простоты мы называем этих мух M-DN мухами, несмотря на то, что они дополнительно экспрессируют PER также в некоторых CRY-отрицательных нейронах (Chatterjee et al., 2018). Clk4.1 M-gal4 самцов также были скрещены с per 0 ; Mai179-gal4 ; uas-per16 самок для получения по 0 ; Mai179-gal4 / +; Clk4.1 M-gal4 / uas-per16 , которые выражают PER в M-LN, E-LN и M-DN. В качестве мух с положительным контролем мы использовали на 0 ; tim-gal4 / + ; uas-per16 / + самцов, которые экспрессируют PER во всех тактовых нейронах. В качестве отрицательного контроля мы использовали мух, которые не экспрессируют PER, т.е. на 0 ; Mai179-gal4 / +; + / +, по 0 ; tim-gal4 / +; + / + и по номерам 0 ; +; uas-per16 / +.

Поведенческие эксперименты и анализ

Все мухи выращивались на среде кукурузной муки / агара с добавлением дрожжей при 20 ° C в LD12: 12. В возрасте 1–3 суток отдельных самцов мух переносили в регистрационные камеры. Двигательную активность регистрировали в течение 3 дней в рамках цикла LD12: 12 с той же фазой, что и во время выращивания, и с интенсивностью света 100 люкс. Впоследствии продолжительность фотопериода была либо увеличена до 14 часов, либо уменьшена до 10 часов для половины животных, соответственно (см. Рисунок 2B).После 6 дней записи фотопериод был дополнительно увеличен (до 16 часов) или уменьшен (до 8 часов). Это было повторено еще через 6 дней записи, так что фотопериод в конечном итоге составил 18 или 6 часов соответственно. Таким образом, активность мух была зафиксирована в следующих LD: (1) 12:12, 14:10, 16: 8, 18: 6 или (2) 12:12, 10:14, 8:16, 6: 18. На протяжении всего периода регистрации данные собирались каждую минуту (т.е. в 1-минутных ячейках).

Рис. 2. Средние актограммы и профили активности 25-30 мух, соответственно, следующих линий: (1) на 0 tim-gal4 мутантный контроль (без PER), (2) мухи с PER только в восьми PDF-положительных латеральных нейронах (PER только в M-LN), (3) мухи с PER только в ITP-положительных и sNPF-положительных латеральных нейронах (per только в E-LN), (4) мухи с PER в большинстве латеральных нейронов ( на в M- и E-LN) и летает с PER во всех тактовых нейронах. (A) Репрезентативное окрашивание анти-PER для правого полушария головного мозга каждого генотипа, соответственно. (B) Двойные графики средних актограмм всех штаммов мух. Мухи были вовлечены в последующие циклы LD, в которых продолжительность дня была либо ступенчато сокращена (LD 12:12, 10:14, 8:16 и 6:18), либо в которых длина дня ступенчато увеличивалась (LD 12:12, 14). : 10, 16: 8 и 6:18). Черные и белые полосы над и под каждой актограммой указывают цикл LD самого короткого и самого длинного фотопериода, соответственно.Чтобы увидеть общую картину увлечения, средние актограммы коротких и длинных дней были объединены в одну составную актограмму для каждого генотипа, в которой актограмма короткого дня (верхняя часть составленных актограмм) была перевернута вертикально (см. Маленькие стрелки на правое поле, указывающее направление потока актограмм). Эти актограммы дают приблизительное сравнение поведения разных генотипов. Приступы активности утром (M) и вечером (E) видны у мух с PER во всех ячейках часов, а также у мух M- и (мух E-LN-осциллятора (см. Красные и синие буквы).Только бой активности M присутствует у мух с PER только в M-LN, и только бой активности E присутствует у мух с PER только в E-LN. Такие приступы активности отсутствуют у мух без PER. В короткие дни на 0 мутантов проявляют значительную ночную активность, которая начинается через несколько часов после выключения света. Начало этой ночной активности видно у всех штаммов мух, кроме тех, у которых есть per во всех нейронах часов, и отмечено пунктирными зелеными линиями.Начало активности M, которое наблюдается только у мух с работающими осцилляторами M и четко проявляется до включения света, отмечено красными пунктирными линиями. (C) Профили средней активности для каждого штамма при всех фотопериодах (циклы LD указаны на левом краю; активность во время светлой фазы соответствующего цикла LD показана серым, а активность во время темной фазы показана черным) . Профили активности нормализованы таким образом, что наивысшая активность была установлена ​​на значение 1.Цветными буквами отмечена ночная (N), утренняя (M) и вечерняя (E) активность соответственно. Черные стрелки указывают на снижение уровня активности в течение дня.)

Необработанные данные отображались в виде актограмм с помощью программы actogramJ (Schmid et al., 2011). Мухи, не пережившие первые два световых режима, были исключены из анализа. По другим данным, средние актограммы и средние профили активности рассчитывались, как описано ранее (Schlichting and Helfrich-Förster, 2015).Для расчета профилей средней активности сначала рассчитывался средний день для каждой мухи, включая второй и последний день при каждом условии. Затем использовали средние дни жизни отдельных мух для расчета профилей средней активности для каждой группы мух. Мы нормализовали средние профили активности так, чтобы максимальная активность составляла 1. Чтобы выявить фазу начала и максимума утреннего (M) и вечернего (E) приступов активности, соответственно, необработанные данные были сглажены фильтром скользящего среднего значения 51 (я.е., каждая записанная ячейка отображается как средние уровни активности всего 51 ячейки: интересующая ячейка плюс 25 ячеек, предшествующих и 25 следующих за интересующей ячейкой). Такая степень сглаживания сделала профиль активности более компактным. Соответствующее время серий M и E можно затем определить, вручную выбрав начало и максимум с помощью указателя мыши. Средние фазы относительно полуночи были рассчитаны для каждого генотипа при каждом фотопериоде. Фазовое соотношение между пиками M и E (Y M, E ) определяли для каждой мухи и усредняли для различных генотипов и фотопериодов.Кроме того, мы вычислили абсолютную среднюю активность (пересечение луча / 10 мин) для каждой мухи в течение 24 часов (= общий уровень активности), во время светлой фазы (= дневная активность) и во время темной фазы (= ночной образ жизни). деятельность).

Статистика

Уровни активности

и M, E были протестированы на предмет значительного влияния фотопериода и генотипа (разные штаммы) с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) после проверки данных на нормальное распределение с помощью теста Колмогорова-Смирнова (Systat 13, версия 13.00.05; SPSS, Чикаго, Иллинойс). Тест Bonferroni post hoc применяли для попарных сравнений. Значения считались значимыми при p <0,05 и сильно значимыми при p <0,001. Когда данные не были распределены нормально, p -значения были скорректированы путем умножения на 10, согласно Глейзеру (1978).

Результаты

Обычные модели активности

по 0 Органы управления

Все мухи, у которых полностью отсутствовал PER, демонстрировали одинаковое поведение, которое показано для контрольных образцов « на 0 tim-gal4 » ( на 0 ; tim-gal4 / +; uas-per16 / +) на рисунках. 2B, C (1-й столбец) и для элементов управления « на 0 uas-per » ( на 0 ; +; uas-per16 / +) на Рисунке 3 (1-й столбец).Во всех протестированных фотопериодах мухи реагировали с высокой активностью на включение и выключение света (так называемые пики включения и выключения света), но у них не было ни утренних, ни вечерних приступов активности, и они были более активны в течение дня. чем ночью. После пика включения света их уровень дневной активности оставался довольно постоянным, тогда как уровень их ночной активности временно снижался после пика выключения света. Это падение активности было более выраженным и длилось всю ночь при длительных фотопериодах (световая фаза> 14 ч), вероятно, потому, что мухи были активны на протяжении всей длинной световой фазы и, следовательно, были физически истощены (см. Средние актограммы на рисунке 2B).Зеленая пунктирная линия на средней актограмме (рис. 2В, 1-й столбец) указывает на увеличение ночной активности (как определено визуальным осмотром) после начального падения. Последняя также видна в средних профилях активности и отмечена зеленой буквой «N» на рисунках 2, 3. Увеличение ночной активности было немного больше в на 0 uas-на контрольных, чем в на 0 tim-gal4 контролей (сравните первые столбцы на рис. 2 с столбцами на рис. 3).Тем не менее, абсолютная величина ночной активности была одинаковой у обоих на 0 контрольных штаммов (см. Ниже). Таким образом, ежедневные изменения активности элементов управления на 0 можно объяснить как реакцию на внешние циклы LD и на их внутреннюю потребность во сне.

Рисунок 3. Нормализованные профили средней активности 25-30 мух, соответственно, следующих линий: (1) на 0 мутантные контроли (нет на ), (2) мухи только с на в ~ 8 CRY-положительных дорсальных задних нейронах ( на в DN 1 p ), (3) мухи с на в большинстве латеральных нейронов и в DN 1 p ( на дюймов). M- и E-LNs и DN 1 p ) и (4) мухи дикого типа (WT CantonS ).Маркировка как на рисунке 1С.

на 0 Мутанты с PER спасены во всех часовых ячейках и элементах управления дикого типа

Паттерн активности на 0 мутантов, у которых PER был спасен под контролем вневременного промотора во всех часовых ячейках (« на 0 tim-gal4 uas-per » = на 0 ; tim-gal4 / +; uas-per16 / +), был неотличим от такового у мух дикого типа (сравните последний ряд рисунка 2 с рядом рисунка 3).Оба штамма демонстрировали типичный паттерн активности: периоды активности M при включении света и активности E при выключении света при коротких и средних фотопериодах. Только при длительных фотопериодах (световая фаза> 16 ч) пики активности Е наблюдались до выключения света. Между активностями M и E у мух была сиеста, которая была более продолжительной при длительных фотопериодах (стрелки на рисунках 2, 3). Характер активности на 0 tim-gal4 uas-на (рис. 2С, последний столбец) показал сильное сходство с таковым у мух дикого типа (рис. 3, последний столбец).Это предполагает, что паттерн экспрессии PER играет более критическую роль в формировании локомоторной активности, чем уровни экспрессии PER, которые могут различаться между трансгенной линией на 0 tim-gal4 uas-на линии и дикими типами.

летает с PER только в M-LN

В отличие от на 0 контролей, мухи летают с PER в M-LN (« на 0 Pdf-gal4 uas-per » = на 0 ; Pdf-gal4 / +; uas-per16 / +) демонстрировал выраженный приступ М-активности, который происходил перед включением света при коротких фотопериодах (рис. 2, 2-й столбец).При LD12: 12 активность M все еще была видна; это началось до включения света и достигло пика около включения света. Однако при длительном фотопериоде утренняя активность и пик включения света были едва различимы. При LD16: 08 «пик включения» мух M-LN длился еще дольше, чем на 0 контрольных животных, но при LD18: 06, паттерн активности мух M-LN и на 0 управления были очень похожи. Наиболее важно то, что у мух M-LN не было ни сиесты, ни активности Е.Их уровень дневной активности оставался постоянно высоким в течение световой фазы без какого-либо увеличения активности в ожидании выключения света (рис. 2, 2-й столбец). Как уже отмечалось в из 0 контрольных групп, выключение света вызвало пик выключения, после которого ночная активность упала почти до нуля (см. Среднюю актограмму на рис. 2В, 2-й столбец). Это падение активности длилось около 2–3 ч, затем уровень ночной активности заметно увеличился (зеленая линия на средней актограмме и зеленая буква «N» на профилях активности).Затем приступ активности М представлял собой второе сильное увеличение ночной активности (красная пунктирная линия на средней актограмме и красная буква «М» в профилях активности).

летает с PER только в E-LN

мух с PER в E-LN (« за 0 Pdf-gal80 mai-gal4 uas-per » = за 0 ; Mai179-gal4 / Pdf-gal80; uas-per16 / +) выставлено нет утренней активности. Их ночная активность была очень похожа на активность на 0 контролей (см. Пунктирную зеленую линию на средней актограмме и букву «N» в профилях активности, показанных на Рисунке 2, 3-й столбец).Однако мухи E-LN показали менее выраженный пик включения света по сравнению с на 0 мутантов, а их дневной уровень активности после пика включения света упал до очень низких уровней (стрелки на рис. 2В, 3-й столбец). . При коротких фотопериодах активность возрастала только после выключения света и проявлялась в виде длинного и ярко выраженного пика выключения. Однако при длительных фотопериодах мухи E-LN демонстрировали ярко выраженный вечерний приступ активности, который, по-видимому, происходил примерно в той же фазе, что и у контрольных мух, с сохранением PER во всех часовых ячейках (рис. 2B, 3-й столбец).

Летает с PER в M- и E-LN

Характер активности мух с PER в M- и E-LN можно рассматривать как смесь активности мух только с M-LN или только с E-LN (рис. 2, 4-й столбец). У мух наблюдались приступы активности M и E с фазой, очень похожей на фазу мух с одним из двух LN-осцилляторов. Наиболее важно то, что при коротких фотопериодах фазы этих двух не были похожи на дикие, а происходили раньше и позже, соответственно. После включения света уровень дневной активности упал и оставался низким до увеличения вечерней активности (стрелки на Рисунке 2B, 4-й столбец).

Летает с PER только в M-DN

Характер активности мух с PER только в M-DN был в принципе аналогичен таковому у мух M-LN. Однако активность M была ниже, а активность M была менее выраженной (рис. 3, 2-й столбец), что позволяет предположить, что M-LN необходимы для выраженной активности M. Кроме того, мухи проявляли признаки E-активности (обозначены как «E?» На фиг. 3), что позволяет предположить, что CRY-положительные клетки DN 1 p , которые экспрессируют PER в этой линии, могут также включать некоторые E-осцилляторы.

Летает с PER в M-, E-LN и M-DN

Характер активности мух с PER в M-LN и M-DN плюс E-LN был очень похож на таковой у мух с PER в M-LN и E-LN, что позволяет предположить, что PER в M-DN вносит лишь незначительный вклад. к появлению и фазе активности M и E (рис. 3B, 3-й столбец). Тем не менее, ночная активность (зеленый «N» на рисунке 2) оказалась значительно ниже у мух, у которых PER был дополнительно в M-DN. Суточная активность снижалась после активности М и оставалась низкой до повышения активности Е (стрелки на Рисунке 3).

Фазы активностей М и Э и взаимосвязь фаз между двумя

Поскольку точные фазы приступов активности M и E трудно увидеть в средних профилях активности, мы определили начало активности M и E и соответствующие им пиковые фазы для каждой мухи и рассчитали средние значения для каждой линии мух (Рисунок 4) . Эти графики показывают, что только мухи, которые экспрессировали PER во всех часовых клетках, демонстрировали фазу М и Е активности дикого типа. У мух с PER, присутствующим только в M-LN, в M-LN и E-LN, или в M-LN, E-LN и M-DN, активность М проявлялась очень рано, а также проявлялась ранняя активность. пик.Самая последняя активность E началась у мух с PER только в E-LN, значительно раньше у мух с PER в M-LN и E-LN или в M-LN, E-LN и M-DN, а самые ранние у мух дикого типа, за которыми следуют мухи с PER во всех часовых ячейках (рис. 4A). Интересно, что наклон начала активности в зависимости от фотопериода был различным для мух, которые экспрессировали PER только в подмножестве нейронов часов, и тех, которые экспрессировали его во всех клетках. У мух с PER во всех часовых клетках начало активности E происходило позже с увеличением фотопериода, в то время как у мух, у которых per только в подмножествах часовых клеток, это наблюдалось только до 12-часового фотопериода.При более длительных фотопериодах (14, 16, 18 ч) фазы начала E снова продвигались, наконец, становясь более ранними, чем фаза начала E у мух дикого типа (рис. 4A). Что касается пиков активности M и E, разница между мухами, которые экспрессируют PER во всех клетках, и мухами, которые делают это только в подмножестве нейронов часов, было менее значительным, но в остальном сходным: пик активности M был значительно раньше у мух с PER в подмножестве нейронов часов до фотопериода 16 ч (рис. 4B).При более длительных фотопериодах мы не могли отличить пик M от пика включенного света и, следовательно, не могли определить его фазу. Пик активности E наступал после выключения света у мух, которые экспрессировали PER только в подмножествах нейронов часов, в то время как у мух дикого типа он был около выключения света. Как наблюдали для начала активности E, при длительных фотопериодах пик E становился раньше у мух с PER только в подмножествах нейронов часов, чем у мух дикого типа (Рисунок 4B).

Рисунок 4. Время утренней и вечерней активности у большинства штаммов, показанных на рисунках 1, 2, при различных фотопериодах. Нам не удалось достоверно определить фазы активности М у мух с PER только в M-DN. Поэтому эти мухи сюда не попадают. (A) Время начала утренней и вечерней активности соответственно. (B) Время пиков активности утром и вечером. (C) Расстояния между пиками утренней и вечерней активности (Y ME ) до светового периода в 14 часов.Планки погрешностей показывают стандартные ошибки среднего. Двусторонний дисперсионный анализ показал четкую зависимость Y ME от фотопериода [ F (5, 604) = 486,579; p <0,001] и на штамме [ F (3, 604) = 173,384; p <0,001], а также значимое взаимодействие между обоими [ F (15, 604) = 7,204; p <0,001], что указывает на то, что реакция на фотопериод значительно различается у разных штаммов.Анализ post hoc показал, что Y ME значительно короче у штамма дикого типа (WT CantonS ) и у мух, у которых PER был спасен во всех часовых клетках, по сравнению с мухами, у которых PER был спасен только в определенных подгруппах ( p <0,001, звездочки). Во всех фотопериодах существует тенденция к тому, что Y ME короче у мух, при этом PER спасается в M-DN в дополнение к M- и E-LN по сравнению только с M- и E- LN. Однако эта разница оказалась лишь значительной ( p = 0.018) под самым длинным днем ​​(14:10), обозначенным разными буквами.

Как отмечалось в более ранних исследованиях (Rieger et al., 2012), расстояние (фазовое соотношение Y ME ) между пиками M и E было небольшим у мух дикого типа при коротких фотопериодах и значительно увеличивалось с увеличением фотопериода (рис. 4C). . То же самое верно и для мух с PER во всех часовых ячейках. Два других штамма, в которых мы могли рассчитать Y ME (мухи с PER в M- и E-LN и мухи с PER в M-, E-LN и M-DN) имели значительно больший Y ME при коротких фотопериодах Y и ME удлинялись менее резко с увеличением фотопериода (рис. 4C).Y ME всегда был длиннее у мух, которые экспрессировали PER только в M- и E-LN, чем у мух, которые обладали PER дополнительно в M-LN. Таким образом, это указывает на то, что Y ME тем короче, чем больше тактовых ячеек экспрессируют PER.

Ночные приступы активности

Одним из поразительных результатов нашего исследования является высокая ночная активность большинства штаммов, которые экспрессируют PER только в подмножествах часовых клеток при коротких фотопериодах. Чтобы визуализировать ночную активность более подробно, мы построили те же нормализованные профили активности, которые показаны на рисунках 2, 3 еще раз, но на этот раз с центром в ночи и только для коротких фотопериодов (рисунок 5).В то время как мухи дикого типа с PER во всех часовых клетках проявляли лишь минимальную ночную активность, ночная активность всех других штаммов была явно выше. Во-первых, это указывает на то, что полностью функциональные часы с PER, присутствующим во всех часовых клетках, подавляют ночную активность (две большие стрелки на рисунке 5, 3-й и 4-й столбцы, соответственно). У из 0 контролей ночная активность (N) наблюдалась на умеренных постоянных уровнях в течение ночи (рис. 5A, 1-й столбец).Это было сопоставимо у мух с PER только в E-LN (рис. 5A, 4-й столбец), но здесь активность N была ниже и уже подавлялась сразу после активности E, как только дни удлинялись (> 8 ч, черный стрелки). У других штаммов активность явно подавлялась сразу после активности E (черные стрелки на рисунке 5) или, в случае мух с PER только в M-LN (рисунок 5A, 3-й столбец), сразу после пика выключения. , и это произошло уже при коротких фотопериодах. После этого падения активность увеличивалась в два этапа, что лучше всего было видно у мух с PER только в M-LN или в M- и E-LN (обозначены зеленым «N» и красным «M» на рис. 5A, 3-й. столбец и рис. 5В, 1-й столбец соответственно).Мы интерпретируем второе повышение активности как ранний пик М. У мух, у которых PER присутствует только в M-DN (рис. 5A, 2-й столбец), вторая ступень увеличения ночной активности едва заметна, что позволяет предположить, что M-DN активирует пик M лишь незначительно, так что это сложно. отличить от пика N. Тем не менее, по сравнению с на 0 контролей (рис. 5A, 1-й столбец), ночная активность явно усиливается, когда PER присутствует в M-DN (рис. 5A, 2-й столбец).У мух, экспрессирующих PER только в M-LN, E-LN и M-DN (рис. 5B, 2-й столбец), ночная активность сильно подавлена, что свидетельствует об ингибирующем эффекте E-LN. В совокупности эти результаты показывают, что некоторые нейроны часов подавляют ночную активность в определенное время в течение ночи, в то время как другие стимулируют ее в другое время ночи.

Рис. 5. Приступы ночной активности различных штаммов при коротких фотопериодах (фотопериоды от 6 до 12 часов). Те же нормализованные профили активности, показанные на рисунках 1, 2, построены таким образом, что ночь центрирована.В (A) показаны на 0 uas-per ; за 0 clk4.1-gal4 uas-per ; за 0 clk4.1-gal4 uas-per ; по 0 Pdf-gal4 uas-per ; и за 0 Pdf-gal80 mai-gal4 uas-per ; тогда как в (B) , за 0 mai-gal4 uas-per ; за 0 clk4.1-gal4 mai-gal4 uas-per ; за 0 тим-гал4 грн-за ; и WT CantonS показаны.Черные стрелки указывают время, в которое снижается ночная активность. В остальном маркировка аналогична рисункам 1, 2. Мухи с PER в M-DN показывают более низкую активность M, чем мухи с PER в M-LN. Следовательно, у этих мух сложнее отличить активность М от общей ночной (N) активности, и мы добавили вопросительный знак к пику М. У мух с PER в M-, E-LN и M-DN активность N отсутствовала, и был виден только ранний пик M, тогда как у мух дикого типа активность N и M оказалась в значительной степени подавленной.Последний обозначен двумя черными стрелками.

Абсолютные уровни дневной и ночной активности

До сих пор мы рассматривали относительную активность мух днем ​​и ночью по нормализованным профилям активности. Чтобы увидеть влияние PER в различных нейронах часов на реальные уровни активности, мы вычислили абсолютные средние значения общей, дневной и ночной активности (в пересечениях лучей за 10 минут) в различные фотопериоды (Рисунок 6). Мы обнаружили, что у большинства видов мух общий уровень активности был максимальным в день равноденствия (LD12: 12) (Рисунок 6A).Тем не менее, уровень активности у разных штаммов сильно отличался. Самый высокий общий уровень активности был обнаружен у мух, которые экспрессировали PER только в M-LN, тогда как самый низкий уровень активности был у мух дикого типа. Аритмические на 0 мутантов показали промежуточные уровни активности, а активность мух с PER, спасенная в разных часовых нейронах, сгруппирована вокруг таковой у мутантов на 0 , иногда ниже, иногда выше (Рисунок 6A).Эти различия в активности согласуются с гипотезой о том, что определенные нейроны часов способствуют активности (например, M-LN), в то время как другие нейроны часов скорее ингибируют активность (например, E-LN и M-DN).

Рисунок 6. Абсолютный общий (A) , дневной (B) и ночной (C) уровней активности у различных штаммов мух во всех фотопериодах (± стандартное отклонение). Значения активности для различных штаммов показаны разными цветами [цветовые коды указаны справа (A) ].Двусторонний дисперсионный анализ показал четкую зависимость общей активности от фотопериода [ F (7, 2 , 209) = 42,997; p <0,001] и на штамме [ F (8, 2 , 209) = 150,759; p <0,001], а также значимое взаимодействие между обоими [ F (56, 2 , 209) = 3,677; p <0,001]. Кроме того, двухфакторный дисперсионный анализ показал четкую зависимость дневной и ночной активности от фотопериода [для дневной активности F (7, 2 , 209) = 14.046; р <0,001; для ночной активности F (7, 2 , 209) = 180,902; p <0,001] и на штамме [для дневной активности F (8, 1 , 109) = 125,203; р <0,001; для ночной активности F (8, 2 , 209) = 107,405; p <0,001], а также значительное взаимодействие между ними [для дневной активности F (56, 2 , 209) = 3.957; р <0,001; для ночной активности F (56, 2 , 209) = 9,585; p <0,001]. В совокупности это указывает на то, что реакция дневной и ночной активности на фотопериод значительно различается у разных штаммов. Не было обнаружено различий в уровнях общей, дневной и ночной активности между на 0 и контрольной группой дикого типа, соответственно. Более подробные объяснения см. В тексте.

Чтобы получить больше информации о влиянии штаммов и фотопериодов на дневную и ночную активность, мы рассчитали дневную и ночную активность различных штаммов во все фотопериоды (Рисунки 6B, C).За редким исключением, дневная активность днем ​​была выше, чем ночью. Отклонения от этого общего паттерна были обнаружены у мух, которые обладали PER только в M- и E-LN или дополнительно в M-DN. При коротких световых периодах эти мухи были явно более активны ночью, чем днем. Мухи с PER только в E-LN также были более активны ночью, чем днем, но только при LD12: 12 и 14:10.

Как уже было обнаружено для общей активности, самые высокие уровни дневной и ночной активности у большинства штаммов наблюдались во время равноденствия (LD12: 12), соответственно (сравните Рисунки 6B, C).Суточная активность снижалась у большинства штаммов, когда дни становились короче или длиннее (Рисунок 6B), в то время как ночная активность снижалась лишь умеренно в короткие дни, но заметно снижалась в длинные дни (Рисунок 6C). Опять же, некоторые штаммы отличались от этого образца. Например, дневная активность мух с PER только в E-LN или в M- и E-LN оставалась высокой даже в течение долгих дней. Суточная активность мух с PER только в M-DN оставалась практически одинаковой во всех фотопериодах (с небольшим увеличением в очень короткие дни), а суточная активность мух с PER в M-, E-LN и M-DN постоянно увеличивалась. с фотопериодом.Ночная активность последних оставалась постоянно высокой при коротких фотопериодах (до LD10: 14), а затем неуклонно снижалась.

В целом, наш анализ профилей активности и уровней активности показал, что стимулирование активности и ингибирование активности, по-видимому, происходят в зависимости от времени и фотопериода (см. Также рисунки 2, 3, 5).

Обсуждение

С момента открытия, что определенные нейроны часов контролируют активность M и E D. melanogaster , многие исследования детально проверяли свойства осцилляторов M и E.Ниже мы обсудим эти исследования в свете наших результатов.

В большинстве исследований манипулировали световой чувствительностью или скоростью колебаний в нейронах часов M и E и проверяли последствия для увлечения или свободного бега мух (Stoleru et al., 2005, 2007; Murad et al., 2007; Picot et al., 2007; Zhang L. et al., 2010; Zhang Y. et al., 2010). Они обнаружили, что осцилляторы M и E не только различаются по своей чувствительности к свету, как первоначально предложили Питтендриг и Даан (1976), но и что они, кроме того, обладают разными способностями контролировать ритмичность в темноте и свете.

Stoleru et al. (2007) экспрессировали киназу Shaggy либо в M-клетках, либо в E-клетках, которая ускоряет часы в соответствующих нейронах, и регистрировали активность мух при коротких и длинных фотопериодах. Они обнаружили, что M-нейроны контролировали фазу M и E-фазы активности в короткие дни (оба стали ранними), в то время как E-клетки не влияли на фазу M-активности в этих условиях. Однако в долгие дни дело обстояло наоборот. Теперь Е-клетки определяли фазу активности М и Е, в то время как М нейроны не влияли на фазу активности Е.Stoleru et al. (2007) пришли к выводу, что M-клетки доминируют в течение долгих ночей, а E-клетки — в долгие дни. Хотя определение E-клеток в этом исследовании было не очень точным (все часовые клетки, кроме таковых M-LN, считались E-клетками), этот результат очень интересен. Это соответствует нашему наблюдению, что мухи с PER только в M-LN вызывают сильную активность M в темноте в короткие дни, но что это уменьшается в длинные дни. Напротив, у мух с PER только в E-LN активность E лучше всего видна в световой фазе долгих дней.Дифференциальное преобладание осцилляторов M и E может даже отражаться в амплитудах пиков M и E у мух дикого типа при коротких и длинных фотопериодах (Rieger et al., 2003) и у мух с PER, спасенным во всех клетках, показанных на рис. Рис. 1. В короткие дни (LD 8:16 и 10:14) их пик M был выше, чем пик E, тогда как противоположное было верно в течение длинных дней (LD 16: 8 и 18: 6).

В других исследованиях использовалось то же определение нейронов M и E, что и в настоящем исследовании, но они не регистрировали активность при разных фотопериодах, а вместо этого меняли интенсивность света в день равноденствия (LD 12:12) или регистрировали мух в постоянной темноте. (DD) или постоянный свет (LL) (Picot et al., 2007; Ригер и др., 2009; Zhang Y. et al., 2010; Chatterjee et al., 2018). Эти исследования показали, что функциональные нейроны M-LN сами по себе могут контролировать ритмическое поведение в постоянной темноте (DD), в то время как функциональные нейроны M-DN или E-LN не могут. И наоборот, только нейроны E-LN могут контролировать ритмичность при постоянном освещении (LL), но только M-LN или M-DN не могут. Таким образом, M-нейроны (особенно M-LN), по-видимому, доминируют при DD, тогда как E-нейроны доминируют при LL (обзор Yoshii et al., 2012), что соответствует исследованиям Stoleru et al. (2007) и наши наблюдения. Picot et al. (2007) предположили существование зависимого от света переключателя между осцилляторами M и E, который требует зрительной системы и помогает животному адаптироваться к сезонным изменениям продолжительности дня, но, к сожалению, они не зарегистрировали мух при разных фотопериодах, чтобы проверить их гипотеза.

Наконец, Chatterjee et al. (2018) обнаружили, что M-LN являются задающими генераторами, которые подают сигнал в M-DN, и оба вместе контролируют активность M.Другими словами, функциональные часы необходимы в M-LN и M-DN для управления активностью M диким типом. Действительно, мы обнаружили здесь, что мухи, которые обладали PER в M-LN и M-DN (в дополнение к E-LN), имели более выраженную активность M в короткие дни (у них отсутствовал пик ночной активности «N»; см. Рисунок 5). Кроме того, они имели Y M, E , подобные дикому типу (фиг. 4C), по сравнению с мухами, которые обладали PER только в M- и E-LN.

Chatterjee et al. (2018) также обнаружили, что E-LN и E-DN контролируют активность E параллельно при низкой интенсивности света (∼50 люкс), но что при более высокой интенсивности света (∼1000 люкс) активность E-DN блокируется. и только E-LN контролирует активность E.Таким образом, в нейронной сети есть светозависимый переключатель, контролирующий активность E. Наиболее важно то, что драйвер Clk4.1M , который мы использовали для управления приводами M-DN также в некоторых E-DN (Zhang Y. et al., 2010; Chatterjee et al., 2018; Рисунок 1), и интенсивность света 100 люкс, которые мы использовали для регистрации мух, вероятно, позволяет E-DN вносить свой вклад в активность E. Это может объяснить, почему мы наблюдали признаки активности E у наших мух с PER в M-LN, особенно при длительных фотопериодах (рис. 3), но большая часть активности E в наших записях, по-видимому, проистекает из E-LN.

Тем не менее, ситуация еще более сложная, потому что нейроны E не являются независимыми от M-LN (= s-LN v ), или, лучше сказать, от PDF, происходящего из s-LN v и l -LN v (Stoleru et al., 2005; Shafer, Taghert, 2009; Yoshii et al., 2009; Guo et al., 2014; Seluzicki et al., 2014; Yao and Shafer, 2014; Liang et al. , 2016, 2017; Schlichting et al., 2016; Menegazzi et al., 2017; Chatterjee et al., 2018). Вкратце, нейроны E экспрессируют рецептор PDF и отвечают на PDF, секретируемый нейронами s-LN v или l-LN v , с задержкой их ритма в нейронной активности (визуализируемой клеточным Ca ). 2+ уровней).Впоследствии это приводит к задержке активности Е. Такая задержка особенно важна при длительных фотопериодах, чтобы поддерживать активность E близкой к сумеречной. Два исследования показывают, что при длительных фотопериодах PDF происходит преимущественно от нейронов l-LN v (Menegazzi et al., 2017; Schlichting et al., 2019b), тогда как, по-видимому, происходит главным образом от s-LN v . клетки в условиях короткого фотопериода и равноденствия (Guo et al., 2014). Это еще раз указывает на то, что в сети нейронных часов Drosophila имеется опосредованное светом переключение цепи при изменении условий освещения.Нейрональная активность l-LN v сильно зависит от света (Cao and Nitabach, 2008; Shang et al., 2008; Sheeba et al., 2008), что соответствует их доминирующей роли в качестве медиаторов, задерживающих активность E. длительные фотопериоды.

Наконец, но это важно, также есть доказательства того, что клетки M-DN реагируют на E-LN (Guo et al., 2016, 2018) и M-LN (Hamasaka et al., 2007) и блокируют их активность через глутамат. сигнализация. Это приводит к блокировке активности M и E в полдень, вызывая сиесту мух.Самое интересное, что яркий свет продлевает сиесту даже в условиях равноденствия (Rieger et al., 2007), и это вызвано особым сигнальным путем высокой интенсивности, который передает сигнал в M-LN, а затем через PDF в M-DN, который в Turn блокирует активность M-LN и E-LN (Schlichting et al., 2019a). Эти исследования проводились только в условиях равноденствия; тем не менее, хорошо вообразить, что описанные пути также действительны при длительных фотопериодах, в которых блокировка осцилляторов M и E в полдень особенно важна для продления сиесты и задержки активности E.

В настоящем исследовании мы обнаружили, что мухи дикого типа проявляли очень низкую активность в полдень и ночь, в то время как уровень активности на 0 мутантов был значительно выше в течение всего 24-часового дня; в частности, в полдень не было видно сиесты. Хотя мы не можем исключить идею о том, что генетический фон используемых штаммов может иметь значение, наши результаты показывают, что основная функция циркадных часов заключается в подавлении активности в менее благоприятное время дня.Это хорошо совпадает с выводами Menegazzi et al. (2012) и Schlichting et al. (2015), которые протестировали функцию PER в более естественных условиях и обнаружили, что PER особенно необходим для предотвращения активности мух в полдень и ночью. То же самое можно сказать и о млекопитающих. Бурундуки [у которых были повреждены часы в супрахиазматических ядрах (SCN)], выпущенные в дикую природу, проводили значительно больше времени вне своей норы в течение ночи и, следовательно, имели более высокий риск нападения хищников по сравнению с контрольными животными (DeCoursey et al., 2000).

Здесь мы показываем, что функциональные циркадные часы, ограниченные основными нейронными кластерами, составляющими осцилляторы M и E (M-LN, M-DN и E-LN), недостаточны для подавления активности аналогично дикому типу. . Мы также показываем, что не все нейроны разных часов подавляют активность, и если они это делают, то подавляют ее в разное время дня. Например, M-LN вообще не подавлял активность, а наоборот сильно ее провоцировал. Это особенно верно для ночной активности при коротких фотопериодах, условиях, при которых M-LN вызывает заметную ночную активность M (Рисунки 5, 6).Однако и суточная активность M-LN была довольно высокой. Сиесты не было, и это было справедливо при всех световых периодах. В отличие от M-LN, M-DN явно подавлял активность, особенно дневную активность (рис. 6), что согласуется с их ролью индукции сиесты. Абсолютный уровень ночной активности был аналогичен уровню на 0 мутантов, но, как обсуждалось выше, M-DN, тем не менее, подавлял ночную активность (N) после пика выключения (или слабого пика «E?» ) (Рисунок 5).Наибольшее подавление активности в течение дня вызывается E-LN или E-LN в сочетании с M-DN (как обсуждалось выше, M-LN, которые также содержат PER в последней комбинации, не вносят никакого вклада) к угнетению дневной активности).

После этого создается впечатление, что ничего не осталось от исходной модели Питтендрига и Даана (1976), в которой увеличение Y M, E объяснялось ускорением осцилляторов M и замедлением осцилляторов E светом. с увеличением фотопериода.Все кажется объяснимым провоцированием и подавлением активности через разные нейроны часов в определенное время дня. Однако это правда только на первый взгляд. Мы обнаружили, что действие различных нейронов часов на активность явно зависело от фотопериода. Кроме того, Y M, E также значительно зависели от фотопериода и увеличивались с увеличением длины дня, даже у мух, которые экспрессировали PER только в подмножествах нейронов часов (рис. 4C). Таким образом, свет, скорее всего, по-разному влияет на скорость колебаний нейронов M и E.Действительно, мухи с PER только в M-LN, M-DN и E-LN и в которых дополнительно отсутствовал CRY, показали внутреннюю десинхронизацию на два компонента, которые свободно работают с короткими и длинными периодами, соответственно — поведение, которое было похоже на мутанты cry 0 с полностью функциональными часами (Yoshii et al., 2012). Таким образом, в принципе кажется, что осцилляторы M ускоряются, а осцилляторы E замедляются при освещении, как предсказывали Питтендрай и Даан (1976). Однако, помимо скорости колебаний, преобладание осцилляторов M и E Drosophila изменяется с увеличением освещенности.Это затрудняет наблюдение изменений скорости в M- и E-клетках мух, которые обладают всеми наборами фоторецепторов, включая CRY. Кроме того, не все тактовые нейроны ведут себя как осцилляторы M и E (например, l-LN v ), а точная функция некоторых тактовых нейронов нам до сих пор неизвестна (см. Рисунок 1). Скорее всего, существует больше, чем просто нейроны M и E, и так называемые нейроны M и E могут регулировать свою функцию в зависимости от условий окружающей среды.

Таким образом, появляется все больше свидетельств того, что циркадные часы Drosophila состоят из пластиковой сети осцилляторов, которые перестраиваются в зависимости от требований окружающей среды.Это объясняет, почему исходная модель осцилляторов M и E Питтендрига и Даана (1976) слишком проста, чтобы описать ситуацию в Drosophila . Здесь мы показываем, что экспрессия PER в разных подмножествах часовых нейронов недостаточна для адаптации поведения мух к разным фотопериодам диким способом (см. Таблицу 1). Возможно, PER необходим не только во всех нейронах часов, но и во всех глиальных клетках для поведения дикого типа. Глиальные клетки все еще в значительной степени игнорируются в циркадных исследованиях, хотя несколько исследований показывают, что они играют активную роль в часах (Zerr et al., 1990; Эвер и др., 1992; Ng et al., 2011; Джексон и др., 2015, 2019; Бранкаччо и др., 2019). Необходимы дальнейшие исследования для проверки этого важного вопроса.

Таблица 1. Вклад различных кластеров часовых нейронов в формирование профиля локомоторной активности дикого типа у D. melanogaster .

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок любому квалифицированному исследователю.

Авторские взносы

PM, KB, VG и MS проводили эксперименты. PM, KB и CH-F разработали исследование и спланировали эксперименты. CH-F написал рукопись при участии PM, KB и FS. Все авторы проанализировали эксперименты.

Финансирование

Это исследование было поддержано Немецким исследовательским фондом (DFG) в проектах A1 и A2 Центра совместных исследований (SFB1047) и индивидуальными грантами для CH-F (FO 207 / 15-1) и PM (ME 4866 / 1- 1).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Франсуа Руайе и Патрика Эмери за предоставленные штаммы мух, Ральфа Станевского за пожертвование антител к PER, Кристиан Герман-Луибл и Тайши Йошии за советы и практическую помощь, а также Дирка Ригера за проведение предварительных исследований.

Список литературы

Bachleitner, W., Kempinger, L., Wülbeck, C., Rieger, D., and Helfrich-Förster, C. (2007). Лунный свет сдвигает эндогенные часы Drosophila melanogaster . Proc. Natl. Акад. Sci. США 104, 3538–3543. DOI: 10.1073 / pnas.0606870104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бранкаччо, М., Эдвардс, М. Д., Паттон, А. П., Смилли, Н. Дж., Чешэм, Дж. Э., Мэйвуд, Э. С. и др. (2019). Автономные часы астроцитов управляют циркадным поведением млекопитающих. Наука 363, 187–192. DOI: 10.1126 / science.aat4104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бивалез В., Менегацци П., Ригер Д., Шмид Б., Хельфрих-Фёрстер К. и Йошии Т. (2012). Система с двумя осцилляторами Drosophila melanogaster при естественных температурных циклах. Хронобиол. Int. 29, 395–407. DOI: 10.3109 / 07420528.2012.668505

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цао, Г., и Нитабах, М. Н. (2008). Циркадный контроль возбудимости мембран в Drosophila melanogaster латеральных нейронов центральных часов. J. Neurosci. 28, 6493–6501. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1503-08.2008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чаттерджи, А., Ламаз, А., Де, Дж., Мена, В., Челот, Э., Мартин, Б. и др. (2018). Реконфигурация сети с несколькими осцилляторами по свету в циркадных часах Drosophila . Curr.Биол. 28, 2007.e4–2017.e4. DOI: 10.1016 / j.cub.2018.04.064

CrossRef Полный текст | Google Scholar

ДеКурси, П. Дж., Уокер, Дж. К., и Смит, С. А. (2000). Циркадный кардиостимулятор у свободноживущих бурундуков: необходим для выживания? J. Comp. Physiol. А 186, 169–180. DOI: 10.1007 / s0035017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Данлэп, Дж. К., Лорос, Дж. Дж., И ДеКурси, П. Дж. (2004). Хронобиология: биологическое хронометраж. Сандерленд, Массачусетс: Sinauer Associates.

Google Scholar

Эвер, Дж., Фриш, Б., Гамблен-Койл, М., Росбаш, М., и Холл, Дж. (1992). Экспрессия гена периодических часов в различных типах клеток в головном мозге взрослых особей Drosophila и мозаичный анализ влияния этих клеток на циркадные поведенческие ритмы. J. Neurosci. 12, 3321–3349. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.12-09-03321.1992

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Глейзер, В.Р. (1978). Varianzanalyse. Штутгарт: Густав Фишер.

Google Scholar

Грима Б., Челот Э., Ся Р. и Руйе Ф. (2004). Утренние и вечерние пики активности зависят от разных часовых нейронов мозга Drosophila . Природа 431, 869–873. DOI: 10.1038 / nature02935

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гуо, Ф., Ю, Дж., Юнг, Х. Дж., Абруцци, К. К., Луо, В., Гриффит, Л. К. и др.(2016). Обратная связь циркадных нейронов контролирует профиль активности сна Drosophila . Природа 536, 292–297. DOI: 10.1038 / природа19097

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Го X., Ван Ю., Синакевич И., Лей Х. и Смит Б. Х. (2018). Сравнение эффекта нокдауна РНКи рецептора 1 тирамина, индуцированного дцРНК и миРНК в мозге медоносной пчелы, Apis mellifera . J. Insect Physiol. 111, 47–52. DOI: 10.1016 / j.jinsphys.2018.10.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хамасака Ю., Ригер Д., Парментье М.-Л., Грау Ю., Хельфрих-Фёрстер К. и Нессель Д. Р. (2007). Глутамат и его метаботропный рецептор в цепях нейронов часов Drosophila . J. Comp. Neurol. 505, 32–45. DOI: 10.1002 / cne.21471

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J.Э., Росбаш М. и Холл Дж. К. (1992). Поведение мутантов Drosophila с измененным периодом циркадного ритма в циклах свет ?: темнота (Diptera: Drosophilidae). J. Поведение насекомых. 5, 417–446. DOI: 10.1007 / BF01058189

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хельфрих-Фёрстер, К., Шафер, О. Т., Вюльбек, К., Гришабер, Э., Ригер, Д., и Тагерт, П. (2007). Развитие и морфология латеральных нейронов, экспрессирующих часы-ген, Drosophila melanogaster . J. Comp. Neurol. 500, 47–70. DOI: 10.1002 / cne.21146

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джексон, Ф. Р., Нг, Ф. С., Сенгупта, С., Ю, С., и Хуанг, Ю. (2015). Регуляция ритмического поведения глиальными клетками. Методы Энзмол. 552, 45–73. DOI: 10.1016 / bs.mie.2014.10.016

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джексон, Ф. Р., Ю, С., и Кроу, Л. Б. (2019). Регуляция ритмического поведения астроцитами. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Биол. doi: 10.1002 / wdev.372 [Epub a head of print].

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Johard, H.A.D., Yoishii, T., Dircksen, H., Cusumano, P., Rouyer, F., Helfrich-Förster, C., et al. (2009). Пептидергические часовые нейроны в Drosophila ?: Ионный транспортный пептид и короткий нейропептид F в подмножествах дорсальных и вентральных латеральных нейронов. J. Comp. Neurol. 516, 59–73. DOI: 10.1002 / cne.22099

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Канеко, М.и Холл, Дж. К. (2000). Нейроанатомия клеток, экспрессирующих гены часов в Drosophila : трансгенная манипуляция периодом и вневременными генами для маркировки перикария нейронов циркадного водителя ритма и их проекций. J. Comp. Neurol. 422, 66–94. DOI: 10.1002 / (sici) 1096-9861 (20000619) 422: 1 <66 :: aid-cne5> 3.0.co; 2-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лян, X., Холи, Т. Э., и Тагерт, П. Х. (2016). Синхронные циркадные ритмы Drosophila демонстрируют несинхронные Са2 + ритмы in vivo . Наука 351, 976–981. DOI: 10.1126 / science.aad3997

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лян, X., Холи, Т. Э., и Тагерт, П. Х. (2017). Серия подавляющих сигналов в циркадной нейронной цепи Drosophila генерирует последовательные ежедневные выходные данные. Neuron 94, 1173.e4–1189.e4. DOI: 10.1016 / j.neuron.2017.05.007

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Майеркак Дж., Сидоте Д., Хардин П. Э. и Эдери И.(1999). Как циркадные часы адаптируются к сезонным понижениям температуры и продолжительности дня. Neuron 24, 219–230. DOI: 10.1016 / S0896-6273 (00) 80834-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Менегацци, П., Далла Бенетта, Э., Бошан, М., Шлихтинг, М., Штеффан-Девентер, И., и Хельфрих-Фёрстер, К. (2017). Адаптация циркадной нейронной сети к фотопериоду у высокоширотных европейских дрозофилид. Curr. Биол. 27, 833–839. DOI: 10.1016 / j.cub.2017.01.036

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Менегацци П., Йоши Т. и Хельфрих-Форстер К. (2012). Лаборатория против природы: две стороны циркадных часов Drosophila . J. Biol. Ритмы 27, 433–442. DOI: 10.1177 / 0748730412463181

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мурад А., Эмери-Ле М. и Эмери П. (2007). Подмножество дорсальных нейронов модулирует циркадное поведение и световые реакции у Drosophila . Neuron 53, 689–701. DOI: 10.1016 / j.neuron.2007.01.034

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нг, Ф. С., Тангреди, М. М., и Джексон, Ф. Р. (2011). Глиальные клетки физиологически модулируют нейроны часов и циркадное поведение кальций-зависимым образом. Curr. Биол. 21, 625–634. DOI: 10.1016 / j.cub.2011.03.027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пико, М., Кусумано, П., Кларсфельд, А., Уэда, Р., и Руайер, Ф. (2007). Свет активирует продукцию вечерних нейронов и подавляет выработку утренних нейронов в циркадных часах Drosophila . PLoS Biol. 5: e315. DOI: 10.1371 / journal.pbio.0050315

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ренн, С.С.П., Парк, Дж. Х., Росбаш, М., Холл, Дж. К., и Тагерт, П. Х. (1999). Мутация гена нейропептида pdf и устранение PDF-нейронов aach вызывают серьезные нарушения поведенческих циркадных ритмов у Drosophila . Ячейка 99, 791–802. DOI: 10.1016 / s0092-8674 (00) 81676-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ригер Д., Фраунхольц К., Попп Дж., Бихлер Д., Диттманн Р. и Хельфрих-Фёрстер К. (2007). Плодовая муха Drosophila melanogaster предпочитает тусклый свет, а пик ее активности приходится на ранний рассвет и поздние сумерки. J. Biol. Ритмы 22, 387–399. DOI: 10.1177 / 0748730407306198

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ригер, Д., Пешель, Н., Дусик, В., Глоц, С., и Хельфрих-Фёрстер, К. (2012). Способность к увлечению в длительные фотопериоды различается у 3 штаммов Drosophila melanogaster дикого типа и модифицируется с помощью моделирования сумерек. J. Biol. Ритмы 27, 37–47. DOI: 10.1177 / 0748730411420246

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ригер Д., Шафер О. Т., Томиока К. и Хельфрих-Фёрстер К. (2006). Функциональный анализ нейронов циркадного водителя ритма у Drosophila melanogaster . J. Neurosci. 26, 2531–2543. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1234-05.2006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ригер Д., Станевски Р. и Хельфрих-Фёрстер К. (2003). Криптохром, сложные глаза, люверсы Хофбауэра-Бюхнера и глазки играют разные роли в захвате и маскировании пути ритма двигательной активности у плодовой мухи Drosophila melanogaster . J. Biol. Ритмы 18, 377–391. DOI: 10.1177 / 0748730403256997

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ригер, Д., Wülbeck, C., Rouyer, F., и Helfrich-Förster, C. (2009). Периодическая экспрессия гена в четырех нейронах достаточна для ритмической активности Drosophila melanogaster в условиях слабого освещения. J. Biol. Ритмы 24, 271–282. DOI: 10.1177 / 0748730409338508

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сондерс, Д. С. (2002). Часы с насекомыми. Амстердам: Эльзевир.

Google Scholar

Schlichting, M., and Helfrich-Förster, C.(2015). Фотический захват у Drosophila оценивается по записям двигательной активности. Methods Enzymol. 552, 105–123. DOI: 10.1016 / bs.mie.2014.10.017

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шлихтинг М., Менегацци П. и Хельфрих-Фёрстер К. (2015). Нормальное зрение может компенсировать потерю циркадных часов. Proc. R. Soc. В 282: 2015 1846. DOI: 10.1098 / rspb.2015.1846

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шлихтинг, М., Menegazzi, P., Lelito, K. R., Yao, Z., Buhl, E., Dalla Benetta, E., et al. (2016). Нейронная сеть, лежащая в основе циркадного увлечения и фотопериодической регулировки сна и активности у Drosophila . J. Neurosci. 36, 9084–9096. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.0992-16.2016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шлихтинг М., Менегацци П., Росбаш М. и Хельфрих-Ферстер К. (2019a). Отчетливый зрительный путь обеспечивает адаптацию циркадных часов к высокой интенсивности света у Drosophila . J. Neurosci. 39, 1621–1630. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.1497-18.2018

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schlichting, M., Weidner, P., Diaz, M., Menegazzi, P., Dalla Benetta, E., Helfrich-Förster, C., et al. (2019b). Опосредованное светом переключение цепей в нейронной тактовой сети Drosophila . Curr. Биол. 29, 3266.e3–3276.e3. DOI: 10.1016 / j.cub.2019.08.033

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шмид, Б., Хельфрих-Форстер, К.и Йошии Т. (2011). Новый плагин ImageJ «ActogramJ» для хронобиологического анализа. J. Biol. Ритмы 26, 464–467. DOI: 10.1177 / 0748730411414264

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шуберт, Ф. К., Хагедорн, Н., Йошии, Т., Хельфрих-Фёрстер, К., и Ригер, Д. (2018). Нейроанатомические детали латеральных нейронов Drosophila melanogaster подтверждают их функциональную роль в циркадной системе. J. Comp. Neurol. 526, 1209–1231. DOI: 10.1002 / cne.24406

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Селузицки А., Флуракис М., Кула-Эверсол Э., Чжан Л., Килман В. и Аллада Р. (2014). Двойные сигнальные пути PDF сбрасывают часы через TIMELESS и резко возбуждают целевые нейроны, чтобы контролировать циркадное поведение. PLoS Biol. 12: e1001810. DOI: 10.1371 / journal.pbio.1001810

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шафер, О., Левин, Дж., Трумэн, Дж., И Холл, Дж. (2004). Ночные мухи: влияние изменения продолжительности дня на циркадные часы Drosophila . Curr. Биол. 14, 424–432. DOI: 10.1016 / S0960-9822 (04) 00131-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шафер, О. Т., Хельфрих-Ферстер, К., Ренн, С. К. П., и Тагерт, П. Х. (2006). Повторная оценка нейрональных циркадных кардиостимуляторов Drosophila melanogaster выявила новые классы нейронов. Дж.Комп. Neurol. 498, 180–193. DOI: 10.1002 / cne.21021

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шафер, О. Т., и Тагерт, П. Х. (2009). Нокдаун РНК-интерференции фактора диспергирования пигмента Drosophila в подмножествах нейронов: анатомическая основа циркадных функций нейропептида. PLoS One 4: e8298. DOI: 10.1371 / journal.pone.0008298

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шанг, Ю., Гриффит, Л.С., и Росбаш, М.(2008). Цепи светового возбуждения и циркадной фоторецепции пересекаются в больших ячейках PDF мозга Drosophila . Proc. Natl. Акад. Sci. США, 105, 19587–19594. DOI: 10.1073 / pnas.0809577105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шиба В., Гу Х., Шарма В. К., О’Дауд Д. К. и Холмс Т. К. (2008). Циркадная и светозависимая регуляция мембранного потенциала покоя и спонтанного возбуждения потенциала действия нейронов циркадного водителя ритма Drosophila . J. Neurophysiol. 99, 976–988. DOI: 10.1152 / jn.00930.2007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Siegmund, T., and Korge, G. (2001). Иннервация кольцевой железы Drosophila melanogaster . J. Comp. Neurol. 431, 481–491. DOI: 10.1002 / 1096-9861 (20010319) 431: 4 <481 :: aid-cne1084> 3.0.co; 2-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Столеру, Д., Наватеан, П., де ла Пас Фернандес, М., Менет, Дж. С., Цериани, М. Ф., и Росбаш, М. (2007). Циркадная сеть Drosophila является сезонным таймером. Ячейка 129, 207–219. DOI: 10.1016 / j.cell.2007.02.038

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Столеру Д., Пэн Ю., Агосто Дж. И Росбаш М. (2004). Связанные осцилляторы контролируют утреннее и вечернее локомоторное поведение Drosophila . Природа 431, 862–868. DOI: 10.1038 / nature02926

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Столеру, Д., Пэн, Ю., Наватин, П., Росбаш, М. (2005). Сигнал сброса между кардиостимуляторами Drosophila синхронизирует утреннюю и вечернюю активность. Природа 438, 238–242. DOI: 10.1038 / nature04192

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Яо З., Шафер О. Т. (2014). Циркадные часы Drosophila представляют собой переменно связанную сеть из нескольких пептидергических единиц. Наука 343, 1516–1520. DOI: 10.1126 / наука.1251285

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йошии Т., Ригер Д. и Хельфрих-Форстер К. (2012). Два часа в мозгу: обновление модели утреннего и вечернего осцилляторов в Drosophila . Прог. Brain Res. 199, 59–82. DOI: 10.1016 / B978-0-444-59427-3.00027-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йошии, Т., Вюльбек, К., Сехадова, Х., Велери, С., Бихлер, Д., Станевский, Р., и другие. (2009). Фактор диспергирования пигмента нейропептида регулирует период и фазу часов Drosophila . J. Neurosci. 29, 2597–2610. DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.5439-08.2009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зерр Д. М., Холл Дж. К., Росбаш М. и Сивицки К. К. (1990). Циркадные колебания периодической иммунореактивности белков в ЦНС и зрительной системе Drosophila . J. Neurosci. 10, 2749–2762.DOI: 10.1523 / jneurosci.10-08-02749.1990

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhang, L., Chung, B.Y., Lear, B.C., Kilman, V.L., Liu, Y., Mahesh, G., et al. (2010). Циркадные нейроны DN1p координируют поступление острого света и PDF для обеспечения устойчивого повседневного поведения у Drosophila . Curr. Биол. 20, 591–599. DOI: 10.1016 / j.cub.2010.02.056

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан Ю., Лю Ю., Билодо-Вентворт Д., Хардин П. Э. и Эмери П. (2010). Свет и температура контролируют вклад конкретных нейронов DN1 в циркадное поведение Drosophila . Curr. Биол. 20, 600–605. DOI: 10.1016 / j.cub.2010.02.044

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Функциональных часов в основных утренних и вечерних нейронах D. melanogaster недостаточно для двигательной активности дикого типа при изменении продолжительности дня

РИСУНОК 6

Абсолютный общий (A) , дневной (B) и ночной (C) уровней активности в…


РИСУНОК 6

Абсолютный общий (A) , дневной (B) и ночной (C) уровней активности у различных штаммов мух во всех фотопериодах (± стандартное отклонение).Значения активности для различных штаммов показаны разными цветами [цветовые коды указаны справа (A) ]. Двусторонний дисперсионный анализ показал четкую зависимость общей активности от фотопериода [ F (7, 2 , 209) = 42,997; p <0,001] и на штамме [ F (8, 2 , 209) = 150,759; p <0,001], а также значительное взаимодействие между ними [ F (56, 2 , 209) = 3.677; p <0,001]. Кроме того, двухфакторный дисперсионный анализ показал четкую зависимость дневной и ночной активности от фотопериода [для дневной активности F (7, 2 , 209) = 14,046; р <0,001; для ночной активности F (7, 2 , 209) = 180,902; p <0,001] и на штамме [для дневной активности F (8, 1 , 109) = 125,203; р <0,001; для ночной активности F (8, 2 , 209) = 107.405; p <0,001], а также значительное взаимодействие между ними [для дневной активности F (56, 2 , 209) = 3,957; р <0,001; для ночной активности F (56, 2 , 209) = 9,585; p <0,001]. В совокупности это указывает на то, что реакция дневной и ночной активности на фотопериод значительно различается у разных штаммов. Не было обнаружено различий в уровнях общей, дневной и ночной активности между на 0 и контрольной группой дикого типа, соответственно.Более подробные объяснения см. В тексте.

Функциональный контекст неоднородности циркадных часов в клетках

Abstract

Характеристика циркадных систем на уровне организма — подход сверху вниз — привела к определению объединяющих свойств, что является отличительной чертой науки хронобиологии. Следующая задача — использовать восходящий подход, чтобы показать, как молекулярные механизмы клеточных циркадных часов работают как строительные блоки этих свойств.Мы рассматриваем новые исследования, в том числе недавно опубликованную статью PLOS Biology Nikhil и его коллег, в которых показано, как запрограммированное, а также стохастическое генерирование вариаций в клеточном циркадном периоде объясняет важные адаптивные особенности увлеченной циркадной фазы.

Образец цитирования: Merrow M, Harrington M (2020) Функциональный контекст неоднородности циркадных часов в клетках. ПЛоС Биол 18 (10):
e3000927.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000927

Опубликовано: 14 октября 2020 г.

Авторские права: © 2020 Merrow, Harrington. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: MM при поддержке Volkswagen Foundation: Life? инициативы по финансированию и LMU в Мюнхене, Friedrich Bauer Stiftung LMU в Мюнхене и WiFo Med LMU в Мюнхене.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращение:
SCN, г.
супрахиазматическое ядро ​​

Циркадные часы обеспечивают временную структуру большинства биологических процессов. Эти внутренние около 24-часовые часы улавливают предсказуемые сигналы в окружающей среде (называемые «zeitgebers»), которые указывают время суток или время года (вставка 1).Регулирование фазы увлечения способствует адаптивному преимуществу циркадных часов [1,2]. В этом смысл существования часов. Как сотовые часы выполняют увлечение, способствующее адаптации?

Вставка 1. Основные характеристики циркадных часов

  1. Захват. Все циркадные часы синхронизируются с цейтгеберами. Zeitgebers сообщают о 24-часовой внешней среде. Вовлечение оценивается по фазе увлечения: соотношению эндогенных и экзогенных колебаний.Например, начало секреции мелатонина варьируется у разных людей и отражает фазу увлечения. Поскольку циркадные часы сложны и контролируются многими генами, увлеченная фаза в беспородных популяциях имеет распределение. На это распределение (хронотип) влияют гены, световая среда и развитие.
  2. Время автономной работы. Замечательным свойством большинства циркадных часов является способность продолжать колебаться даже при отсутствии цикла Цайтгебера. Внутренние фазовые отношения резко меняются при переходе от циклов Цайтгебера к постоянным условиям, демонстрируя важную роль увлечения в адаптивной функции циркадных часов.Период циркадных часов в отсутствие zeitgebers составляет приблизительно, но не точно, 24 часа.

Организация циркадных систем

Циркадные системы (рис. 1) иногда сравнивают с оркестром, когда многие исполнители должны слушать дирижера. Для наших целей игроки являются уникальными и разнообразными сотовыми осцилляторами. Проводником клетки является ее zeitgeber, надежно передающий темп. Подобно тому, как музыканты в оркестре реагируют согласно определенному набору правил, это происходит с вовлечением частей циркадной системы.

Фаза, в которую вовлекаются циркадные часы, связана с другим свойством суточных часов: периодом свободного ритма, который можно наблюдать в постоянных условиях окружающей среды (см. Вставку 1). Более длительный свободный ритм обычно приводит к более поздней фазе увлечения по сравнению с более короткой. Это было продемонстрировано на различных уровнях, демонстрируя повсеместное распространение принципов циркадной биологии: не только целые организмы проявляют эти свойства, но и органы и клетки внутри них [3,4].

Фаза увлечения зависит не только от периода [5,6]. Еще один важный фактор — сила цикла Цайтгебера. «Сила» может определяться интенсивностью света или количеством часов солнечного света в день или, вместо этого, чувствительностью системы отклика к свету. Также фигурирует амплитуда эндогенных колебаний.

Центральные и периферические клеточные циркадные часы

Все клетки не равны. У каждого из них есть контекст, который может смягчить их увлечение цейтгеберами.У млекопитающих проекции сетчатки передают световую среду супрахиазматическому ядру гипоталамуса (SCN) мозга (рис. 1). Нейрональные осцилляторы в SCN демонстрируют доказательства сильной связи, посредством которой группы клеток обмениваются информацией о циркадной фазе для создания стабильных фазовых соотношений [7]. Изменения окружающей среды, такие как сезонные изменения продолжительности дня, отражаются в изменении фазовых соотношений между нейрональными осцилляторами SCN [8]. Нарушение нейронной связи в срезах SCN указывает на то, что эта тесная связь ведет к узкому диапазону вовлечения [3,9] (see Box 2).Это отражается на уровне поведения. Диапазон захвата мышей составляет от 21 до 28 часов, а у людей — от 22 до 26,5 часов [10].

Вставка 2. Циркадная организация

Сигналы из внешней среды, которые достоверно представляют внешний день для циркадных часов (« zeitgebers »), сигнализируют телу о времени суток и смене времен года, здесь (рис. 1) показаны изменения продолжительности светового дня (« фотопериод » ). Zeitgebers контролируют фазы ритмов тела относительно внешнего дня (« увлечение »).В отсутствие zeitgebers клетки демонстрируют ритмы продолжительностью около суток (« циркадных периодов »), но с диапазоном продолжительности цикла (« циркадных периодов »). В большей части тела эти клеточные часы не влияют на синхронизацию друг друга и являются « несвязанными, », но в области мозга, называемой супрахиазматическим ядром ( SCN ), клеточные часы образуют сеть связанных осцилляторов. Различия в структуре ячеистых часов могут отражаться в измененных свойствах уноса.Например, часы SCN имеют более узкий диапазон длин цикла по сравнению с часами периферической клетки. (Периферийные часы имеют более широкий «диапазон увлечения »).

В периферических клеточных часах цейтгеберы могут приходить как изнутри, так и извне (рис. 1). Однако, как правило, именно SCN, увлеченный светом / темнотой, определяет суточные ритмы физиологии и поведения, которые, в свою очередь, создают клеточные zeitgebers (например, температуру тела, потребление пищи и гормональные выбросы). Эти сигналы используются множественными часами тела для увлечения.Если критические факторы окружающей среды изменяются (например, пища становится дефицитной или доступна только в определенное время), биологические часы могут отключиться от сигнала SCN и сдвинуть свою фазу в соответствии с новым временем zeitgeber (например, доступностью пищи). Изолированные периферические органы демонстрируют демпфирующие циркадные колебания in vitro. Однако клетки в этих органах могут демонстрировать длительные индивидуальные клеточные колебания; Ключевое различие, по-видимому, состоит в том, что клетки периферических органов демонстрируют слабое или полное отсутствие клеточного взаимодействия [11], так что они дрейфуют в противофазе друг с другом.

Неоднородность клеточного циркадного периода

Наблюдение за тем, что ритмичность затухает из-за дрейфа колебательных сигналов, подразумевает вариабельность периода свободного движения клеток, наблюдение, которое справедливо как для SCN, так и для периферических клеток [12-15]. Отдельные клетки показывают распределение периодов свободного хода и увлеченных фаз при мониторинге с использованием репортеров экспрессии генов. В статье, опубликованной в 2019 году в BioRxiv [16] и в недавнем выпуске PLOS Biology [4], рассматриваются эти проблемы.Кроме того, в работах Ли и его коллег [17,18] сообщается об аналогичных результатах с использованием различных клеточных линий (иммортализованные фибробласты уха мыши по сравнению с клетками остеосаркомы человека U-2 OS по сравнению с клетками 3T3), таким образом предполагая, что это общее свойство клеточных часов. Клональные линии можно субклонировать, чтобы получить линии с коротким или длинным периодом — от 22 до 28 часов [4,16]. Циркадный период этих субклонов показал степень стабильности, которая, в некоторой степени, передавалась по наследству. Удлиненные или укороченные периоды были не из-за спонтанных мутаций, а, скорее всего, из-за модуляции экспрессии генов часов посредством эпигенетических модификаций.Доводы в пользу метилирования особенно сильны, и во многих случаях эти метки могут передаваться от материнской дочерней клетке [18]. Действительно, было показано, что метилирование регулирует циркадный период [19].

Эти исследования показывают, что возникновение изменчивости в период автономной работы не является стохастическим в том смысле, что клетка может быть короткой в ​​один день и длинной в следующий, а скорее, что (посредством пока еще неизвестных механизмов) стохастические эпигенетические модификации предопределяют ячейку на определенный период автономной работы, пока эти отметки не будут удалены.То, что циркадные часы допускают стохастический шум [20], должно было указывать на то, что генерация шума внутри системы функционирует.

Часы на все времена года?

Зачем биологические часы встраивать механизмы для изменения характеристик уноса снизу вверх? Посчитаем пути! Центральные циркадные часы должны интерпретировать предсказуемые изменения в световой среде. Для некоторых млекопитающих это выражается в репродуктивном статусе «все или ничего». Сезонная корректировка циркадной фазы связана с «последействием периода»: период автономной работы после воздействия длительного фотопериода отличается от периода, наблюдаемого после короткого фотопериода [21].Более того, изменения в метилировании клеток мозга связаны с сезонными реакциями [22]. Последствия периода у мышей, находящихся в циклах свет / темнота разной длины (Т-циклы), связаны с изменениями статуса метилирования SCN [19], что приводит к изменению свойств сети, что подтверждает идею о том, что механизм, характерный для линий субклонированных клеток, может быть связан с к адаптивному характеру увлечения. Что касается людей, сезонные изменения, например, депрессии, хорошо задокументированы, и есть соблазн предположить, что основной механизм в SCN, позволяющий справляться с систематическими изменениями в световой среде, может быть нарушен.Находясь в искусственной среде с низким освещением, мы можем эффективно поставить под угрозу нашу «эндогенную цепь Мархова» — циркадные часы, поскольку они предсказывают предстоящую световую среду на основе предыдущей.

Фаза увлечения на поведенческом уровне систематически меняется в течение жизни, при этом у подростков наблюдается заметная задержка времени сна [23]. Это предполагает эндогенный сдвиг в интерпретации света как zeitgeber, но с таким же успехом он может быть реализован посредством систематических изменений характеристик вовлечения пейсмекерных клеток или обратной связи по ним.Недавно мы предположили, что поздний хронотип в подростковом возрасте может быть опосредован инсулиноподобным фактором роста – 1 [24], который экспрессируется в период полового созревания на высоких уровнях и вызывает как опережающие, так и замедляющие фазовые сдвиги в активности промотора гена часов в захваченных клетках гипоталамуса. в культуре тканей. Интересно, что метилирование также рассматривается как механизм, обеспечивающий экспрессию IGF-1 [25].

Известно, что независимо от изменения хронотипа, обусловленного развитием, время человеческого поведения имеет наследственный компонент.Взломать генетику хронотипа было сложно. Частично это может быть связано с беспорядком человеческого поведения в сочетании, как мы видим, с изменяющимися характеристиками часов отдельных компонентов системы часов. Удивительно, но с помощью очень субъективных и ограниченных вопросов, GWAS, опрашивая сотни тысяч геномов, дает сотни генов-кандидатов в качестве регуляторов хронотипа. Помимо «обычных подозреваемых» (известных часовых генов), список связанных с хронотипом генов включает несколько генов, которые регулируют метилирование, такие как TET1, MGMT и METTL15 [26].

Откуда берется точность?

Удивительно и удивительно, что эти исследования субклонированных клеток и их межклональных различий предполагают механизм определения хронотипа и сезонных ответов. Это будет иметь значение даже для хронофармакологии. Но что мы можем узнать об увлечении, которое часто называют точным, из набора периодичностей в изолированных клетках? Как указано выше, период является показателем увлеченной фазы, что подтверждается Nikhil и его коллегами [1], которые показали, что субклоны с более длительным периодом автономной работы увлекаются до 5.На 8 часов позже, чем у тех, у кого более короткий период автономной работы. Набор несвязанных ячеек с различными периодами автономной работы будет захватывать ряд фаз (рис. 2). Таким образом, вовлеченная фаза клеточной культуры (а также расширение органа или организма) представляет собой совокупность всех клеток в популяции, дающую широкий дневной пик. Мы отмечаем, что Карр и Уитмор показали этот феномен на отдельных клетках рыбок данио, посредством чего клетки с разными периодами и амплитудами вовлечены в циклы свет / темнота с разными относительными фазовыми углами [27].Более того, это уже было предложено в качестве механизма, облегчающего SCN-опосредованное сезонное поведение [8]. Экспрессия часовых генов и, следовательно, нижестоящих, регулируемых часами генов, будет скорее шире, чем уже в течение дня в условиях увлечения. Это привлекательная концепция, позволяющая сделать так, чтобы процессы, регулируемые часами, были меньше похожи на свет, управляемый переключателем включения / выключения, а больше на процесс, управляемый диммером.

Рис. 2. Понятие увлеченной фазы из уровня популяций клеток.

Кривые, показанные на этом рисунке, представляют увлеченную фазу в течение первых 6 часов дня (горизонтальная ось). По-видимому, гомогенные клетки демонстрируют диапазон периодов автономной работы и, следовательно, диапазон вовлеченных фаз (левая панель, каждая предполагаемая клеточная линия масштабирована до амплитуды 1). Центральная панель изображает тот же набор кривых, но с вертикальной осью, масштабированной пропорционально панели справа, которая показывает сумму отдельных профилей, показанных слева.Эта просто полученная аддитивная кривая напоминает, например, профили биолюминесценции, показывающие регулируемую часами экспрессию генов, как показано у Nikhil и его коллег [4]. Фактические кривые экспрессии должны варьироваться в зависимости от того, что определяется количественно — они могут быть шире или уже в зависимости от того, что измеряется, и от распределения фаз, увлеченных компонентами.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000927.g002

Что же тогда означает точность уноса на функциональном уровне? По сути, это среднее значение многих клеточных часов, которые должны показывать постоянство фазы изо дня в день.Учитывая, что набор периодов автономной работы показывает почти нормальное распределение и что изо дня в день этот период является стабильным, коллективная увлеченная фаза — даже если она представлена ​​в виде широкого пика — будет стабильной изо дня в день, если не будет. это событие, которое вызывает продвижение или задержку фазы увлечения, заставляя набор клеточных периодов быть короче или длиннее, соответственно. Ячейки с экстремальными периодами будут иметь небольшое влияние на фазу пика, а скорее на фазу начала или смещения.Обсуждаемые здесь исследования отметили, что клоны с более длительными периодами автономной работы показали большую вариативность и были менее точными от цикла к циклу. Предполагается, что они покажут менее точный унос, и это можно легко проверить. Можно было бы ожидать, что подгонка кривой (функция синуса или косинуса) к данным всех видов суточных ритмов покажет более высокий коэффициент корреляции — по дням — для начала экспрессии гена по сравнению со смещением. Если это так, это снова механизм, который встроен в систему с некоторым функциональным коррелятом.

Правило фаз-периодов

То, как организмы находят свою нишу в окружающей среде, является наиболее важной физиологической функцией циркадных часов. Если существует формальная взаимосвязь между увлеченной фазой и периодом свободного хода — некоторые называют это правилом — то наблюдение частично наследуемого повторяющегося распределения периодов в популяции клональных клеток может означать, что циркадная система задействует ряд вовлеченных фаз. в любой момент времени (рис. 2). Биологические часы построены снизу вверх с этой функцией, которая, вероятно, влияет на часы на всех уровнях.Это кажется важным ключом к разгадке того, как природа заставила часы адаптироваться к изменяющейся среде, которая все еще остается в высшей степени предсказуемой — и которая стала гораздо менее предсказуемой из-за «проблемы» нашего поведения. Эволюция смогла приспособиться к ночным и дневным видам и даже наземным животным или тем, кто живет за Полярным кругом. Смена часовых поясов и посменная работа? Не так много.

Ссылки

  1. 1.
    Додд А.Н., Салатия Н., Холл А и др. Циркадные часы растений увеличивают фотосинтез, рост и выживаемость. Наука (80-) . 2009. pmid: 16040710
  2. 2.
    Woelfle MA, Ouyang Y, Phanvijhitsiri K, Johnson CH. Адаптивное значение циркадных часов: экспериментальная оценка цианобактерий. Курр Биол . 2004. 14 (16): 1481–1486. pmid: 15324665
  3. 3.
    Abraham U, Granada AE, Westermark PO, Heine M, Kramer A, Herzel H. Связь управляет диапазоном увлечения циркадных часов. Мол Сист Биол . 2010; 6 (438): 438. pmid: 21119632
  4. 4.Nikhil K, Korge S, Kramer A. Наследственная вариабельность экспрессии генов и стохастичность определяют клональную гетерогенность в циркадный период. ПЛоС Биол . 2020; 18 (8): e3000792. doi: https://doi.org/https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000792 pmid: 32745129
  5. 5.
    Tokuda IT, Schmal C, Ananthasubramaniam B, Herzel H. Концептуальные модели вовлечения, смены часовых поясов и сезонности. Front Physiol . 2020. pmid: 32411006
  6. 6.
    Реми Дж., Мерроу М., Роеннеберг Т.Циркадная поверхность увлечения: различные T, τ и фотопериод у Neurospora crassa. Дж Биол Ритмы . 2010. pmid: 20876812
  7. 7.
    Атон SJ, Herzog ED. Пойдемте вместе, прямо… сейчас: синхронизация ритмов в циркадных часах млекопитающих. Нейрон . 2005. pmid: 16301169
  8. 8.
    Шаап Дж., Альбус Х., ВандерЛест Х.Т., Эйлерс РНС, Детари Л., Мейер Дж. Х. Неоднородность ритмических нейронов супрахиазматического ядра: последствия для циркадной формы волны и фотопериодического кодирования. Proc Natl Acad Sci U S A . 2003. 100 (26): 15994–15999. pmid: 14671328
  9. 9.
    Херцог Э.Д., Атон С.Дж., Нумано Р., Сакаки Ю., Тей Х. Точность времени в циркадной системе млекопитающих: надежные часы из менее надежных нейронов. Дж Биол Ритмы . 2004. pmid: 14964702
  10. 10.
    Ашофф Дж., Поль Х. Фазовые отношения между циркадным ритмом и его zeitgeber в пределах диапазона увлечения. Naturwissenschaften . 1978. 65 (2): 80–84.pmid: 345129
  11. 11.
    Guenthner CJ, Luitje ME, Pyle LA, et al. Циркадные ритмы PER2 :: LUC в индивидуальных первичных гепатоцитах и ​​культурах мышей. Ямадзаки С., изд. PLOS ONE . 2014; 9 (2): e87573. pmid: 24498336
  12. 12.
    Валлийский Д.К., Logothetis DE, Meister M, Reppert SM. Отдельные нейроны, диссоциированные от супрахиазматического ядра крысы, экспрессируют независимо фазированные циркадные ритмы возбуждения. Нейрон . 1995. 14 (4): 697–706. pmid: 7718233
  13. 13.Leise TL, Wang CW, Gitis PJ, валлийский DK. Устойчивые клеточно-автономные циркадные колебания в фибробластах, выявленные с помощью шестинедельной визуализации биолюминесценции PER2 :: LUC на отдельных клетках. PLOS ONE . 2012; 7 (3). pmid: 22479387
  14. 14.
    Браун С.А., Флери-Олела Ф., Нагоши Э. и др. Продолжительность периода экспрессии циркадных генов фибробластов широко варьируется среди людей. ПЛоС Биол . 2005; 3 (10). pmid: 16167846
  15. 15.
    Валлийский Д. К., Ю Ш., Лю А. С., Такахаши Д. С., Кей С. А..Визуализация биолюминесценции отдельных фибробластов выявляет устойчивые, независимо фазированные циркадные ритмы экспрессии часовых генов. Курр Биол . 2004. pmid: 15620658
  16. 16.
    Нихил К.Л., Корге С., Ахим К. Наследственная вариабельность экспрессии генов определяет клональную гетерогенность в циркадный период. bioRxiv . 2019.
  17. 17.
    Ли Й, Шан Й, Десаи Р. В., Кокс К. Х., Вайнбергер Л. С., Такахаши Дж. С.. Клеточная неоднородность, вызванная шумом, в циркадной периодичности. Proc Natl Acad Sci U S A . 2020. pmid: 32358201
  18. 18.
    Ли Й, Шан Й, Килару Г. и др. Эпигенетическая наследственность циркадного периода в клональных клетках. Элиф . 2020. pmid: 32459177
  19. 19.
    Аззи А., Даллманн Р., Кассерли А. и др. Циркадное поведение легко перепрограммируется пластическим метилированием ДНК. Nat Neurosci . 2014. pmid: 24531307
  20. 20.
    Михалческу И., Хсинг В., Лейблер С. Устойчивый циркадный осциллятор, обнаруженный у отдельных цианобактерий. Природа . 2004. 430 (6995): 81–85. pmid: 15229601
  21. 21.
    Питтендрай К.С., Даан С. Функциональный анализ циркадных ритмоводителей у ночных грызунов. Дж. Комп. Physiol A . 1976; 106 (3): 333–355.
  22. 22.
    Стивенсон Т.Дж., Прендергаст Б.Дж. Обратимое метилирование ДНК регулирует сезонное фотопериодическое измерение времени. Proc Natl Acad Sci U S A . 2013. pmid: 24067648
  23. 23.
    Роеннеберг Т., Кюнле Т., Прамсталлер П.П. и др.Маркер окончания подросткового возраста. Курр Биол . 2004; 14 (24). pmid: 15620633
  24. 24.
    Брейт А., Мик Л., Шредельсекер Дж., Гейбель М., Мерроу М., Гудерманн Т. Инсулиноподобный фактор роста-1 действует как цейтгебер на экспрессию гена циркадных часов гипоталамуса посредством передачи сигналов киназы-3β гликогенсинтазы. Дж. Биол. Хим. . 2018. pmid: 30217816
  25. 25.
    Ouni M, Belot MP, Castell AL, Fradin D, Bougnères P. Промотор P2 гена IGF1 является основным эпигенетическим локусом чувствительности к GH. Pharmacogenomics J . 2016. pmid: 25869012
  26. 26.
    Джонс С.Е., Лейн Дж. М., Вуд А. Р. и др. Полногеномный анализ ассоциации хронотипа у 697 828 человек дает представление о циркадных ритмах. Нац Коммуна . 2019. pmid: 30696823
  27. 27.
    Carr AJF, Whitmore D. Визуализация отдельных светочувствительных часовых ячеек показывает колеблющиеся периоды автономной работы. Nat Cell Biol . 2005. pmid: 15738976

Улучшение функции суточных часов в раковых клетках подавляет рост опухоли | BMC Biology

Индукция функции циркадных часов в клетках меланомы B16

Сначала мы охарактеризовали генерацию циркадных ритмов в клетках меланомы B16.Репортерные конструкции, состоящие из гена люциферазы под контролем промотора Bmal1 или Per2 ( Bmal1 Luc , Per2 Luc ), стабильно трансфицировали в клетки B16. Биолюминесценция этих клеток была аритмичной (рис. 1а, от -44 до 0 ч). Однако при добавлении DEX, агониста глюкокортикоидного рецептора (который экспрессируется в клетках B16 [28]), который, как известно, индуцирует циркадные ритмы в культивируемых клетках, мы наблюдали ритмичный Bmal1 Luc и Per2 Luc Активность промотора с ожидаемыми противофазами (рис.1а) [34], которые, однако, ослабляются раньше, чем в различных нераковых клеточных линиях [35, 36].

Рис. 1

Индукция экспрессии гена ритмических часов и гена клеточного цикла в клетках B16. a Среднее значение биолюминесценции Bmal1-Luc ( черная линия ) или Per2-Luc ( серая линия ) после обработки клеток B16 дексаметазоном ( DEX ). б
Per2-Luc биолюминесценция отдельных клеток B16 ( черный : один циркадный пик, серый : два циркадных пика, пунктирный серый : более двух циркадных пиков) и их среднее значение ( толстая серая линия ) после DEX лечение (n = 38). c Типичный пример средней биолюминесценции Per2-Luc клеток B16 после обработки форсколином ( FSK ). d Типичные примеры усредненной биолюминесценции Bmal1-Luc клеток B16 после обработки тепловым шоком (43 ° C в течение 30 мин, черная линия ) и необработанных контролей ( серая линия ). e Экспрессия гена часов в клетках B16 через 8–28 часов после сывороточного шока (n = 19–23, 3–4 лунки / момент времени; косинусно-волновая регрессия, F-тест: p <0.001). f j Часы экспрессии гена в культивируемых клетках B16 через 24–44 часа после обработки DEX ( черная линия ). Элемент управления показан серым цветом . Значимые ритмы проиллюстрированы подобранными косинусоидальными кривыми, в противном случае данные связаны прямыми линиями между точками данных, что указывает на отсутствие значимых циркадных ритмов (косинусно-волновая регрессия, F-тест: контроль: все гены p > 0,05, DEX: Per1 и Cry1 : p <0.05, n = 18, 3 скв. / Момент времени; Per2 и Bmal1: p <0,0001, n = 35–36, 5–6 лунок / момент времени; Nr1d1 : p <0,001, n = 32–36, 5–6 лунок / момент времени). k p Экспрессия шести генов клеточного цикла в клетках B16 через 24–44 часа после обработки DEX. Значимые ритмы проиллюстрированы подобранными косинусоидальными кривыми, в противном случае данные связаны прямыми линиями между точками данных, что указывает на отсутствие значимых циркадных ритмов (n = 36, 6 лунок / момент времени, мультигармоническая косинусно-волновая регрессия, F-тест: контроль: п > 0.05, DEX: p21 и c-Myc : p <0,05; Wee1 и Cyclin E : p <0,01; Cdk1 и Cdk2 : p <0,001). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Подробнее о статистике см. Дополнительный файл 1.

Чтобы выяснить, является ли потеря ритмичности после нескольких циклов результатом циркадной дисфункции отдельных клеток или десинхронизации ритмических клеток, мы проанализировали биолюминесценцию Per2-Luc на уровне отдельных клеток (рис.1b, дополнительный файл 3, дополнительный файл 4A – E). Хотя ритмы в циркадном диапазоне (с первого по второй пик: 24,2 ± 1,4 часа, со второго по третий пик: 25,3 ± 2,0 часа, с третьего по четвертый пик: 24,3 ± 1,5 часа; дополнительный файл 4E, F) были индуцированы DEX в ~ 90 % клеток они быстро погасли в течение двух-трех циклов: 50% и 36% клеток показали второй или третий циркадный пик, соответственно, но циркадные ритмы биолюминесценции были значительно подавлены во всех клетках через 132 часа (рис. 1b). , Дополнительный файл 4A – D, G).Точно так же амплитуда одноклеточных ритмов упала примерно на 80% в течение трех циклов, а фазовое распределение стало рассредоточенным через 48 часов (дополнительный файл 4H, I). Повторные обработки показали, что подавление гена часов не было связано с гибелью клеток (дополнительный файл 4J). В целом, эти данные указывают на подавление экспрессии часового гена в клетках B16, а не на десинхронизацию между отдельными клетками.

Дополнительный файл 3: Индукция экспрессии гена ритмических часов в клетках B16. Per2-Luc одноклеточная биолюминесценция культивируемых клеток B16 в течение 142 часов после обработки дексаметазоном. (AVI 1831 кб)

Экспрессия гена ритмических часов также наблюдалась при использовании альтернативных методов активации гена часов [30, 37]: FSK, активатор аденилатциклазы и пути цАМФ / PKA (рис. 1c), тепловой шок (рис. 1d) и сывороточный шок (рис. 1e) все индуцировал колебания транскрипта в клетках B16. Помимо Bmal1 и Per2 , мРНК часовых генов Per1 , Cry1 и Nr1d1 также ритмично колебались в клетках B16 после обработки DEX, но не в необработанных клетках (рис.1f – j).

В целом эти результаты показали, что клетки B16 обладают нестабильным, но индуцируемым циркадным осциллятором. Мы решили воспользоваться этим свойством для изучения роли внутренних часов опухолевых клеток в пролиферации клеток и росте опухоли.

Клеточный цикл находится под циркадным контролем после лечения дексаметазоном in vitro

Поскольку было показано, что молекулярные часы регулируют экспрессию генов, кодирующих регуляторы клеточного цикла [2], мы решили изучить экспрессию таких генов в клетках B16.Клетки B16 обрабатывали DEX в течение 2 часов, собирали в течение 24 часов и тестировали на экспрессию мРНК гомолога WEE 1 1 ( Wee1 ), Cyclin-зависимой киназы 1 (Cdk1), Cdk2 , Cyclin E , Онкоген миелоцитоматоза c ( c-Myc ) и Ингибитор циклин-зависимой киназы 1A ( p21 ) . Все шесть генов обнаруживают преобладающие компоненты 24-часового ритма в изобилии транскриптов как следствие обработки DEX (Fig. 1k-p).

Поскольку эти факторы участвуют в контрольных точках клеточного цикла, мы оценили влияние обработки DEX на распределение клеток B16 по стадиям клеточного цикла. Клетки собирали в разные моменты времени в течение 24 ч, окрашивали на включение BrdU и 7AAD и анализировали проточной цитометрией (рис. 2a, b). Было обнаружено, что доля клеток в фазах G0 / 1, G2 / M и S ритмична в клетках, обработанных DEX, в то время как контрольные клетки не обнаруживают циркадных вариаций (Fig. 2c – e). Интересно, что меньше клеток вошло в фазу S через 24, 36 и 42 ч после обработки DEX (рис.2e), что указывает на меньшую репликацию ДНК, в то время как больше клеток было обнаружено в фазах G0 / G1 (рис. 2c).

Рис. 2

Дексаметазон ( DEX ), форсколин ( FSK ) и лечение тепловым шоком снижают пролиферацию клеток B16. a , b Типичные точечные диаграммы проточной цитометрии и c e общий анализ фаз клеточного цикла в клетках B16 через 24–44 часа после обработки DEX (или необработанных), окрашенных на включенный BrdU и с 7AAD. Значимые ритмы проиллюстрированы подобранными косинусоидальными кривыми, в противном случае данные соединяются прямыми линиями между точками данных, что указывает на отсутствие значимых циркадных ритмов ( n = 24, 6 лунок / момент времени, косинусно-волновая регрессия, F-тест: Контроль: все гены / фазы p > 0.05, DEX: p <0,05; двусторонний дисперсионный анализ ANOVA, тест posthoc, группа: ** p <0,01, *** p <0,001). f , г Общее количество живых клеток 12–48 ч ( f ) и 48–68 часов ( г ) после обработки DEX или FSK и контролями (n = 6–8 лунок / момент времени) . ч Количество живых клеток 0–96 ч после контроля или обработки DEX в 0 ч (1x DEX) или через 0 и 48 ч (2x DEX) (n = 4–12 лунок / момент времени). i Количество живых клеток 0–72 ч после теплового шока или контрольной обработки ( n = 6 лунок / момент времени).Двусторонний дисперсионный анализ, тест posthoc, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 для DEX по сравнению с контролями; +++ p <0,001 FSK по сравнению с контролем; ## p <0,01 по сравнению с 1x DEX; x p <0,05, xx p <0,01, xxx p <0,001 по сравнению с 2x DEX. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Подробнее о статистике см. Дополнительный файл 1.

Индукция циркадных часов замедляет пролиферацию клеток B16 in vitro

Учитывая, что активация циркадных часов в клетках B16 запускает ритмы генов и фаз клеточного цикла, мы затем проверили, влияет ли активация часов в клетках B16 на их пролиферацию.Через 36 часов после обработки DEX мы насчитали значительно меньше живых клеток, чем без обработки (рис. 2f), в то время как количество мертвых клеток в среде не изменилось через 12–48 часов (дополнительный файл 4N). Эффект был даже более выраженным через 2 дня, с примерно на 50% меньше живых клеток, но с аналогичным количеством мертвых клеток после обработки DEX (рис. 2g, дополнительный файл 40). Следует отметить, что количество живых и мертвых клеток было одинаковым до и сразу после окончания 2-часовой обработки DEX, что позволяет предположить, что лечение не вызывало острой клеточной токсичности (дополнительный файл 4K).

Поскольку ритмы быстро затухают после лечения (рис. 1), мы проверили, может ли повторное лечение DEX дополнительно подавлять пролиферацию клеток. В то время как однократная обработка DEX значительно снизила количество клеток через 50 часов, вторая обработка дополнительно уменьшила количество клеток через 96 часов (рис. 2h). Время удвоения популяции (PDT) увеличивалось до 22,7 ч в одиночных DEX-обработанных клетках и далее до 23,0 ч в двойных DEX-обработанных клетках по сравнению с 16,5 ч PDT в необработанных контрольных клетках. Окрашивание аннексином V показало, что различия в количестве клеток не были связаны с различиями в уровнях апоптоза (дополнительный файл 4P).Общее количество клеток уменьшилось еще больше после трех процедур DEX, вводимых каждые 48 ч (дополнительный файл 4L, M).

Аналогичные эксперименты были проведены и с другими стимулами, активирующими часы B16 (рис. 1). Как одиночная обработка FSK (рис. 2f, g), так и повторная обработка FSK (дополнительный файл 4M) были столь же эффективны, как DEX в замедлении пролиферации клеток B16. Кроме того, лечение FSK не повлияло на показатели гибели клеток (дополнительный файл 4N, O) и не повлияло резко на количество клеток сразу после 2-часовой обработки (дополнительный файл 4K).Более того, воздействия на клетки 30-минутного теплового шока было достаточно для уменьшения пролиферации, не влияя на апоптоз (рис. 2i, дополнительный файл 4Q). После теплового шока ФДТ увеличилась до 20,7 ч по сравнению с 17,2 ч в необработанных клетках. Эти данные предполагают, что уменьшение пролиферации клеток может быть связано с действием на внутреннюю функцию часов, поскольку активация экспрессии часового гена была общим знаменателем всех трех методов лечения.

Дексаметазон активирует циркадные часы в опухолях B16

Клетки меланомы B16, которые представляют собой хорошо зарекомендовавшую себя и широко используемую модель меланомы человека на мышах [38], образуют легкие и клетки.c. опухоли при введении в хвостовую вену и подкожно соответственно (дополнительный файл 5A, B). Анализ экспрессии гена циркадных часов в опухолях легкого B16 выявил подавленную или аритмическую экспрессию Per1 , Per2 и Bmal1 , в то время как наблюдались устойчивые циркадные колебания в соседней легочной ткани (рис. 3a). Точно так же экспрессия Per1 , Per2 , Bmal1 и Nr1d1 была аритмичной при п / к. Опухоли B16 (рис.3б).

Рис. 3

Инъекция дексаметазона ( DEX ) индуцирует экспрессию гена ритмических часов в опухолях B16 in vivo .
a , b Экспрессия гена часов в легком и опухолях легкого B16 (a) ( n = 21–22; косинусоидальная регрессия: Bmal1 : опухоль: p > 0,05, легкое: p <0,01, n = 22, 3-4 мыши / момент времени; Per1 : опухоль: p > 0.05, легкое: p <0,05; Per2 : опухоль: p <0,05, легкое: p <0,0001; Двусторонний дисперсионный анализ: взаимодействие: p <0,0001, группа: p <0,0001, время: p <0,0001) и подкожные ( sc ) опухоли (b) (n = 15–16, 2–3 мыши / временная точка, косинусно-волновая регрессия, F-тест: все гены: p > 0,05). c Биолюминесценция культивированного среза опухоли Bmal1 Luc , повторно обработанного DEX ( серых столбцов ). d Снимки биолюминесценции Bmal1-Luc отдельных клеток B16 в срезе опухоли легкого в течение 44 часов в отсутствие ( левая панель, ) или более 48 часов после обработки DEX ( правая панель ) из дополнительного файла 6 e i Экспрессия гена часов в подкожных (sc) опухолях после повторной внутриопухолевой инъекции DEX или фосфатно-солевого буфера (PBS) ( n = 9–10, 2–3 мыши / момент времени; два -way ANOVA: временной эффект: Per2 и Cry1 : p <0.05, Per1 и Nr1d1 : p <0,01, Bmal1 : p <0,001; групповой эффект: Per1 и Cry1 : p <0,05, Per2 и Nr1d1 : p <0,001, Bmal1 : p <0,05; posthoc test, групповой эффект: * p <0,0,5, ** p <0,01, *** p <0,001). j Экспрессия белка BMAL1 в опухолях, обработанных DEX или PBS, генерированная s.c. инъекция ( n = 11–12, 3 мыши / момент времени, косинусно-волновая регрессия, F-тест: PBS: p > 0,05, DEX: p <0,01; двусторонний дисперсионный анализ: группа p <0,0001, время: p <0,01) повторно лечили в течение 8–11 дней. Значимые ритмы проиллюстрированы подобранными косинусоидальными кривыми, в противном случае данные соединяются прямыми линиями между точками данных, что указывает на отсутствие значимых циркадных ритмов. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.Подробнее о статистике см. Дополнительный файл 1.

DEX, агонист рецептора глюкокортикоидов, хорошо известен для сброса клеточных часов, индуцируя экспрессию гена Per [39]. При повторном добавлении DEX мы наблюдали ритмичную экспрессию репортера Bmal1-люциферазы в культурах срезов эксплантированных опухолей легкого B16 (фиг. 3c). Более того, мониторинг отдельных клеток в том же срезе опухоли легкого показал отсутствие ритмов Bmal1 до лечения, но циркадные колебания Bmal1 после обработки DEX (дополнительный файл 6, рис.3d). Таким образом, DEX индуцирует de novo ритмическую экспрессию гена Bmal1 в отдельных клетках B16, а не синхронизирует клеточные осцилляторы. Это согласуется с данными для отдельных клеток, полученными на клетках B16 in vitro (рис. 1, дополнительные файлы 3 и 4).

Дополнительный файл 6: Мониторинг биолюминесценции в отсутствие и после индукции экспрессии гена ритмических часов в клетках опухоли легкого B16. Одноклеточная биолюминесценция Bmal1-Luc в срезе опухоли легкого B16 в течение 44 часов в отсутствие обработки DEX и в течение 68 часов после обработки DEX.(AVI 2935 кб)

Для дальнейшего подтверждения активации опухолевых часов с помощью DEX in vivo, s.c. в опухоли вводили DEX внутри опухоли каждые 48 ч, чтобы гарантировать поддержание активации часов опухоли. Экспрессия гена ритмических часов в опухолях была обнаружена после обработки DEX, но не PBS (рис. 3e – i). Экспрессия Per1 , Per2 , Cry1 и Nr1d1 продемонстрировала значительный эффект времени и лечения. Ритмичность экспрессии мРНК Bmal1 не достигла значимости (рис.3i). Однако анализ ANOVA показал влияние времени (см. Дополнительный файл 1) и иммуногистохимии на п.к. срезы опухолей выявили значительный ритм уровней белка BMAL1 в опухолях, обработанных DEX, но не в опухолях, обработанных PBS (фиг. 3j, дополнительный файл 5C, D).

Эффективность и специфичность внутриопухолевых инъекций оценивали путем инъекции метиленового синего в опухоли. Введенная жидкость охватила всю ткань опухоли через 6 часов после внутриопухолевой инъекции, но отсутствовала в окружающих тканях (дополнительный файл 5E).Для дальнейшей оценки специфичности ответа экспрессия часового гена в печени — незлокачественной периферической ткани — сравнивалась у мышей, которым вводили PBS и DEX: мы не обнаружили значительных различий между группами лечения (дополнительный файл 5F).

В целом эти результаты показали, что опухоли B16 обладают подавленным, но индуцируемым циркадным осциллятором. Более того, эти эксперименты показали, что повторная инъекция DEX последовательно индуцирует экспрессию генов ритмических часов в опухолях B16, а не повторно синхронизирует их.Возможность сравнивать опухоли B16 с функцией циркадных часов или без них дала нам возможность проверить роль внутренних часов опухоли в регулировании клеточного цикла и роста опухоли.

Клеточный цикл находится под циркадным контролем после лечения дексаметазоном опухолей B16

Мы измерили экспрессию регуляторов клеточного цикла в п / к. Опухоли B16 собирали в течение 24 часов. Подобно данным, полученным in vitro (рис. 1k – p), ритмичная экспрессия белков CYCLIN E, p21 и c-MYC была обнаружена в опухолях, обработанных DEX, но не в опухолях, обработанных PBS (рис.4a – c, дополнительный файл 7A – C). С другой стороны, WEE1, CDK1, CDK2 и p57, прямая мишень глюкокортикоидного рецептора [40], не обнаруживают ежедневных изменений в DEX-обработанных опухолях (Fig. 4d-g).

Рис. 4

Инъекция дексаметазона ( DEX ) индуцирует ритмические события клеточного цикла и снижает рост опухоли B16 in vivo .
a г Экспрессия белка клеточного цикла в подкожных опухолях после повторной внутриопухолевой инъекции DEX или фосфатно-солевого раствора ( PBS ) каждые 2 дня в течение 8-11 дней ( n = 16-18 , 4–5 мышей / временная точка, F-тест: PBS: все гены: p > 0.05; DEX: CDK1, CDK2, p57: , p > 0,05; c-MYC: p ≤ 0,05; WEE1, p21: p <0,01; ЦИКЛИН E: p <0,001). ч л Анализ фазового распределения клеточного цикла и апоптоза в п / к опухоли ( n = 15–18, 3–5 мышей / временная точка; F-тест: PBS все фазы: p > 0,05, DEX: G2 / M: p > 0,05; G0 / G1, S, апоптоз: p <0,05; митотический индекс: p <0,01). м Объем с.c. опухоли у мышей C57BL / 6 J, которым в день 0, 2, 4, 6, 8 и 10 внутри опухоли вводили DEX или PBS ( n = 3–11 мышей / группа / временная точка, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA: p <0,0001; posthoc тест: *** p <0,001). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). n Объем н.у. опухоли у мышей NSG, которым в день 0, 2, 4 и 6 внутри опухоли вводили DEX или PBS ( n = 4 мыши / группа, двухфакторный ANOVA: p <0,0001; posthoc-тест: * p < 0.05, *** р <0,001). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Подробнее о статистике см. Дополнительный файл 1.

Гомогенизированные опухолевые клетки, собранные в разные моменты времени, окрашивали на включение BrdU и 7AAD. Доля клеток в фазах G0 / 1 и S была ритмичной в DEX-обработанных контрольных опухолях, тогда как PBS-обработанные опухоли не показали циркадных вариаций (рис. 4h – j, дополнительный файл 7D). Интересно, что меньшее количество ритмических клеток вошло в фазу S в опухолях, обработанных DEX, что указывает на меньшую репликацию ДНК, тогда как больше клеток было обнаружено в фазах G0 / G1.Важно отметить, что обработка DEX уменьшала, а не увеличивала количество клеток с задержкой G0, на что указывает окраска Ki67 / 7AAD in vitro (см. Контрольные клетки в дополнительном файле 8). В соответствии с результатами, полученными при окрашивании BrdU, количество клеток в фазе G1 было увеличено, в то время как количество клеток, распределенных в фазах S / G2 / M, было немного уменьшено (сравните рисунки 2 и 4 и дополнительный файл 8). Таким образом, снижение количества клеток после обработки DEX не было вызвано остановкой клеточного цикла. Более того, даже несмотря на то, что вход в фазу G2 / M не контролировался ритмично в опухоли, митотический индекс, оцененный с помощью окрашивания pHh4, указывал на ритмичный процент клеток, подвергающихся митозу (рис.4k, дополнительный файл 7E). Интересно, что клетки опухолей, обработанных DEX, подвергались апоптозу циркадным образом (рис. 4l, дополнительный файл 7F).

Лечение дексаметазоном замедляет рост опухоли B16

Учитывая, что активация циркадных часов в опухолях B16 запускает ритмы генов и фаз клеточного цикла, мы затем оценили, сопровождалась ли активация функции часов в опухолях B16 снижением роста опухоли . С этой целью s.c. Рост опухоли B16 сравнивали между опухолями, обработанными DEX и PBS.Обработка DEX значительно замедляла рост опухоли (примерно на 60% через 8 дней) по сравнению с обработкой PBS (рис. 4m). Однако важно отметить, что окрашивание аннексином V показало, что различия в росте опухолей не были связаны с различиями в уровнях апоптоза, потому что аналогичная доля апоптотических клеток была обнаружена в опухолях, обработанных DEX и PBS (при усреднении за 24-часовой день). , PBS: 14,6 ± 2,3% по сравнению с DEX: 11,5 ± 4,6, F-тест дополнительной суммы квадратов: p = 0,25; рис. 4l).

Чтобы исключить, что снижение роста опухоли после лечения DEX может быть вызвано DEX-индуцированной инфильтрацией иммунных клеток в опухоль, мы повторили этот эксперимент на иммунодефицитных мышах NSG, у которых отсутствуют Т-клетки, В-клетки и естественные клетки-киллеры.Подобно результатам для хозяев C57BL / 6J, рост опухоли был сильно снижен с помощью DEX у мышей NSG (рис. 4n), и не было обнаружено различий в уровнях инфильтрации оставшихся иммунных клеток между опухолями, обработанными DEX и PBS, у мышей NSG. (Дополнительный файл 9A – C). Опять же, доля клеток, подвергающихся апоптозу, существенно не различалась между DEX- и PBS-обработанными опухолями, собранными в циркадном времени (CT) 14 у мышей NSG (дополнительный файл 9D). Более того, пропорции клеток, подвергающихся делению клеток (G1 / S / G2 / M), и тех, которые находятся в остановке G0, не изменились при лечении опухолей DEX у мышей NSG (дополнительный файл 9E).Вместе с результатами, полученными in vitro, которые исключили остановку клеточного цикла (дополнительный файл 8A), и у мышей C57BL / 6J, которые показали больше клеток в фазе G0 / G1 на CT14 после обработки DEX, эти результаты показали, что клетки остаются больше в фазе G1 и меньше проходят в фазу S.

Нокдаун

Bmal1 отменяет эффекты дексаметазона на гены часов и гены клеточного цикла

Чтобы проверить, является ли активация часов в опухолях B16 причинной связью между лечением DEX и ингибированием роста опухоли, эксперименты были повторены в Опухоли B16 с нарушенными циркадными часами.Используя лентивирусный вектор, мы стабильно ввели в клетки B16 shРНК против Bmal1 , необходимого компонента циркадных часов [4]. Клетки, трансфицированные Bmal1 shRNA, экспрессировали на ~ 80% меньше РНК Bmal1 и на ~ 65% меньше белка BMAL1, чем контрольные клетки Scrambled shRNA (рис. 5a, b). Клетки B16, стабильно экспрессирующие shRNA против Bmal1 или Scrambled shRNA, вводили подкожно мышам с образованием опухолей, не имеющих функциональных часов, либо контрольных опухолей.Подобно нетрансфицированным опухолям, экспрессия часового гена показала значительные циркадные ритмы в DEX-обработанных, но не обработанных PBS опухолях Scrambled shRNA (сравните Рис. 3 и Рис. 5c-g). В опухолях Bmal1 shRNA экспрессия Bmal1 была снижена на ~ 70% в опухолях, обработанных как DEX, так и PBS (фиг. 5c). Соответственно, экспрессия генов-мишеней BMAL1 Per1 , Per2 , Cry1 и Nr1d1 была подавленной и аритмичной, что указывает на эффективное нарушение механизма часов в опухолях (рис.5г – ж). Таким образом, нокдаун Bmal1 полностью предотвращал индукцию циркадных ритмов с помощью DEX в опухолях Bmal1 shRNA.

Фиг.5

Bmal1 нокдаун предотвращает индуцированные дексаметазоном ( DEX ) циркадные ритмы и эффекты на рост опухоли in vivo. a , b
Эффективность нокдауна Bmal1 оценивали на экспрессию гена с помощью ПЦР в реальном времени ( n = 3–7, критерий суммы рангов Манна-Уитни: p <0.05) (a) и проточная цитометрия для экспрессии белка ( n = 6, критерий суммы рангов Манна-Уитни: p <0,01) (b). c г Экспрессия гена часов в опухолях, обработанных DEX или фосфатно-солевым буфером (PBS), образованных подкожной (п / к) инъекцией Scrambled shRNA- или Bmal1 трансфицированных shRNA клеток B16, обрабатываемых каждые 2 дня в течение 11 –13 дней. Значимые ритмы проиллюстрированы подобранными косинусоидальными кривыми, в противном случае данные соединяются прямыми линиями между точками данных, что указывает на отсутствие значимых циркадных ритмов.(n = 15–16, 3–4 мыши / временная точка; двусторонний дисперсионный анализ: Bmal1 , Per2 и Cry1 : группа: p <0,0001, время: p <0,0001; Per1 : группа: p <0,0001, время: p > 0,05; Nr1d1 : группа: p <0,0001, время: p <0,001). h m Экспрессия гена клеточного цикла в опухолях, обработанных DEX или PBS, генерированная подкожно инъекция Scrambled shRNA- или Bmal1 shRNA-трансфицированных клеток B16.Значимые ритмы проиллюстрированы подобранными косинусными кривыми, в противном случае данные связаны прямыми линиями между точками данных, что указывает на отсутствие значимых циркадных ритмов ( n = 14–16, 3–4 мыши / временная точка; двусторонний дисперсионный анализ ANOVA: группа: все гены: p <0,0001, время: Cdk1 и Cyclin E : p > 0,05, Cdk2 и Wee1 : p <0,05, p21 и c-Myc : р <0.01). n Относительный объем опухоли Scrambled shRNA или Bmal1 shRNA s.c. опухоли, инъецированные внутри опухоли DEX или PBS на 0, 2, 4 и 6 день. Опухоли с скремблированной шРНК: n = 7–22, двусторонний дисперсионный анализ ANOVA, p <0,0001; Bmal1 shRNA опухолей: n = 10–20, двусторонний дисперсионный анализ: p > 0,05 (нет значимой разницы между DEX и PBS на протяжении всего эксперимента). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Подробнее о статистике см. Дополнительный файл 1.

Ритмическая экспрессия гена Cyclin E , p21 и c-Myc была обнаружена только в обработанных DEX опухолях Scrambled shRNA; Cdk1 , Cdk2 и Wee1 не показали ежедневных изменений в соответствии с данными по белку клеточного цикла (сравните рис.5h – m и рис. 4a – f). Важно отметить, что отмена DEX-индуцированной активации циркадных часов в опухолях Bmal1 shRNA отражалась аритмической экспрессией генов клеточного цикла в этих опухолях. Соответственно, нокдаун Bmal1 in vitro также предотвращал индуцированные DEX ритмы в фазах клеточного цикла (дополнительный файл 8A – E).

Нокдаун

Bmal1 предотвращает ингибирующий эффект дексаметазона на рост опухоли

Затем мы попытались определить, необходима ли функция часов в опухолях B16 для DEX-индуцированного снижения роста опухоли.Как и ожидалось, опухоли B16, экспрессирующие скремблированную shРНК, росли медленнее во время лечения DEX: через 7 дней опухоли, обработанные DEX, были на ~ 60% меньше, чем опухоли, обработанные PBS (рис. 5n), и это согласуется с ростом нетрансфицированных опухолей ( Рис. 4м, н). Напротив, объемы опухолей были неотличимы у мышей, обработанных DEX и PBS, несущих опухоли Bmal1 shRNA (фиг. 5n). Таким образом, DEX не влиял на рост опухоли после нокдауна Bmal1 . Анализ времени удвоения объема Scrambled и Bmal1 shRNA опухолей подтвердил эти результаты (Scrambled shRNA: PBS: 53.3 ч, DEX: 84,0 ч; Bmal1 shRNA: PBS: 50,1 ч, DEX: 50,0 ч). Аналогичные результаты были получены in vitro с использованием клеток, трансфицированных Bmal1 и Scrambled shRNA (данные не показаны).

В соответствии с данными, полученными с использованием мышей NSG (рис. 4n), DEX не влиял на уровни инфильтрации иммунных клеток в опухолях B16, инокулированных сингенных мышей C57BL / 6J, или в нокдаун-опухолях Bmal1 , на что указывают аналогичные значения для В-клетки, дендритные клетки, CD4 + и CD8 + Т-клетки, макрофаги, нейтрофилы и моноциты (дополнительный файл 8F – L).Эти данные подтвердили, что более медленный рост опухоли не был вызван действием DEX на инфильтрацию иммунных клеток. В целом, эти результаты убедительно подтверждают идею о том, что активация функции циркадных часов в опухолях B16 замедляет их рост.

Усиление циркадных ритмов замедляет рост опухоли HCT-116

Чтобы проверить связь между циркадными часами и ростом опухоли за пределами нашей модели с использованием меланомы мыши, мы обработали клетки карциномы толстой кишки человека HCT-116 с помощью DEX и измерили экспрессию гена часов как а также пролиферация и апоптоз до 48 ч после лечения.Клетки HCT-116 проявляли экспрессию гена ритмических часов после обработки DEX (рис. 6a, b), что могло быть связано либо с синхронизацией часов отдельных клеток, либо с активацией часов в клетках de novo. После этой обработки пролиферация клеток HCT-116 сильно снизилась, в то время как уровни апоптоза не пострадали (фиг. 6c, d).

Рис. 6

Дексаметазон ( DEX ) индуцирует циркадные ритмы и снижает пролиферацию клеток HCT-116 и рост опухоли in vivo. a , b
Экспрессия гена Per2 и Nr1d1 в культивируемых клетках HCT-116 через 24–44 ч после обработки DEX.Значимые ритмы проиллюстрированы подобранными косинусоидальными кривыми, в противном случае данные связаны прямыми линиями между точками данных, что указывает на отсутствие значимых циркадных ритмов ( n = 17–18, 3–4 лунки / временная точка, косинусно-волновая регрессия, F-тест : DEX: p <0,05, контроль: p > 0,05). c , d Количество клеток (c) и апоптотические клетки, окрашенные Аннексином V (d) через 24–72 часа после DEX или контрольной обработки ( n = 5–6 лунок / момент времени).Двусторонний дисперсионный анализ, тест posthoc, * p <0,05, **** p <0,0001. e Объем подкожных опухолей HCT-116 у мышей NSG, которым на 0, 2, 4, 6, 8, 10 и 12 день вводили DEX или фосфатно-солевой буфер ( PBS ) ( n = 5 мыши / группа / временная точка, двусторонний дисперсионный анализ, p <0,0001). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Подробнее о статистике см. Дополнительный файл 1.

Аналогичен B16 s.c. опухолей у мышей C57BL / 6 J и NSG, рост опухолей, образованных у мышей NSG после инокуляции клеток HCT-116, сильно замедлился после обработки DEX (фиг. 6e). Эти данные подчеркивают возможность того, что контроль скорости деления клеток за счет усиления циркадных часов и, таким образом, контроль роста опухоли не ограничен клетками меланомы мыши и может быть в целом применим к раковым клеткам человека и другим типам рака.

Исполнительное функционирование: построение внутренних часов

Дети, которым сложно управлять исполнительными функциями, часто не могут справиться с абстрактными концепциями.Эта слабость может повлиять на все, от установления дружеских отношений до понимания уроков истории, но есть еще одна большая абстракция, с которой вы сталкиваетесь каждый день: время.

Вы почти наверняка испытывали чувство «потери счёта времени» или даже то, что время, кажется, ускоряется или замедляется в определенных ситуациях. Это чувство хуже для детей с проблемами исполнительного функционирования, поскольку у них нет базовых внутренних часов, по которым они могли бы работать, и, следовательно, они не знают, что такое минута.Для этих детей цифра на часах по сути бессмысленна.

Как и все остальное, разработка внутренних часов — это приобретенный навык, а это значит, что вы можете научить им своего ребенка. Вот как.

Ditch Digital и переходите на аналог

Цифровые часы легче читать, но они не показывают ход времени, как стрелки аналоговых часов. Например, если вашему ребенку говорят, чтобы он был готов через 20 минут, он просто взглянет вверх и увидит, что числа на часах загадочным образом изменились.Вместо этого замените аналоговые часы. Частые проверки покажут, что большая рука все ближе и ближе к крайнему сроку, что будет постоянным напоминанием о том, как быстро на самом деле движется время.

Чтобы помочь ребенку визуализировать время, купите недорогие настенные часы с пластиковым циферблатом в местном магазине канцелярских товаров. Очень маленькие дети могут начать учиться «чувствовать» время с помощью шаблона Wondertime Clock, простой распечатки, которая позволяет заменять числа на животных для справки. В руки также попадает животное: быстрый колибри для секундной стрелки, белочка для минутной стрелки и черепаха для часовой стрелки.Эти животные в доступной форме оживляют скорость времени.

Рабочие часы

Для детей постарше можно использовать те же настенные часы как «рабочие часы». Всякий раз, когда у вас есть крайний срок — будь то выполнение домашнего задания или уход на уроки игры на фортепиано — используйте маркер для сухого стирания, чтобы отметить его на рабочих часах. Для этого просто закрасьте «клин» времени между текущим положением минутной стрелки и тем местом, где она будет в указанный вами крайний срок. Предложите ребенку проверить, как минутная стрелка приближается к концу цветной части.

Хотя эти шаги просты, они являются мощным инструментом для визуализации абстрактного времени. Это помогает детям осознать, как проходит время, и помогает развить навыки управления временем, которые они могут использовать по мере роста.


Наслаждайтесь этими статьями по теме
Объяснение исполнительной функции
СДВГ, исполнительной функции и силы изображений
Исполнительная функция и математика
Улучшение навыков исполнительной функции

Разделение функции центральных часов у дрозофилы через специфичные для клетки часы, опосредованные CRISPR нарушение гена

Циркадные ритмы — это 24-часовые колебания физиологических функций и поведения, включая двигательную активность, функцию иммунной системы, метаболизм и сон (Allen et al., 2016; Ulgherait et al., 2016; Stone et al., 2012; Hill et al., 2018; Ширасу-Хиза и др., 2007; Панда, 2016; Vaccaro et al., 2017). Нарушение циркадной регуляции является общей чертой старения и связано с множеством неблагоприятных последствий для здоровья, такими как диабет и рак (Rosbash and Takahashi, 2002; Maury et al., 2010; Turek et al., 1995; Wulff et al. , 2010). Циркадные ритмы управляются «молекулярными часами» или белками, которые регулируют ритмическую экспрессию генов. Работа с Drosophila имела решающее значение для понимания молекулярных часов, транскрипционной петли отрицательной обратной связи с четырьмя основными белками: Clock, Cycle, Period и Timeless (рисунок 1A) (Allada et al., 1998; Хантер-Энсор и др., 1996; Рутила и др., 1998; Сегал и др., 1994; Сегал и др., 1995; Vosshall et al., 1994). Вкратце, Clock and Cycle активируют транскрипцию периода и вневременного , которые после трансляции димеризуются и перемещаются в ядро, где они связываются с Clock and Cycle, тем самым ингибируя свою собственную транскрипцию; эта петля молекулярной обратной связи повторяется с 24-часовой периодичностью (рис. 1А). Важно, что основные компоненты молекулярных часов у Drosophila законсервированы у людей (Ch and Takahashi, 2006).

Набор инструментов для клеточно-специфического CRISPR-опосредованного нарушения основных циркадных регуляторов.

( A ) Схема транскрипционной / трансляционной петли отрицательной обратной связи, которая управляет ритмической экспрессией и активностью четырех основных циркадных регуляторов: Period (Per), Timeless (Tim), Clock (Clk) и Cycle (Cyc).( B ) Схема путей повреждения и репарации ДНК, опосредованных CRISPR-Cas9. ( C ) Схема плазмиды (pCFD6, адаптированная из Port and Bullock, 2016), используемая для генерации UAS-sgRNA 4x трансгенных мух. Д.м . = Drosophila melanogaster. Операционные системы. = Oryza sativa , азиатский рис. ( D ) Диаграмма, показывающая целевые сайты sgRNA для acp98AB ( acp , серый), периода ( на , оранжевый) и вневременного ( tim , синий), пронумерованных в порядке 5 Положение «-3» в соответствующей конструкции UAS-sgRNA 4x .Стрелки = экзоны; закрашенные прямоугольники = промоутеры и UTR. * tim sgRNA имеет делецию одной пары оснований в области Cas9-связывающего каркаса (см. Материалы и методы). ( E ) Схема из ~ 150 часовых нейронов, организованных в следующие анатомические и функциональные кластеры в мозге Drosophila : дорсальные нейроны (DN1, DN2, DN3), боковые задние нейроны (LPN), задние боковые нейроны (LNd), и малые и большие вентральные латеральные нейроны (s-LNv, 5 th s-LNv, l-LNv).

https://doi.org/10.7554/eLife.48308.002

В Drosophila ~ 150 нейронов в головном мозге имеют молекулярные часы и контролируют циркадную локомоторную активность (рис. 1E) (Top and Young, 2018). Эти часовые нейроны объединяются в восемь подгрупп, определяемых их анатомическим расположением: маленькие и большие латеральные вентральные нейроны (s-LNvs и l-LNvs), 5 th s-LNv, дорсальные латеральные нейроны (LNds), латеральные задние нейроны (LPNs). ) и три отдельных кластера дорсальных нейронов (DN1, DN2 и DN3) (рис. 1E).Эксперименты по удалению клеток и клеточному спасению выявили два набора нейронов часов, которые контролируют циркадную локомоторную активность: s-LNv Pdf + составляют «утренний осциллятор» и контролируют утренний пик активности, тогда как 5 th s-LNv LNds составляют «вечерний осциллятор» и контролируют вечерний пик активности (Stoleru et al., 2004; Grima et al., 2004; Yao et al., 2016). В классической парадигме циркадных нейронных схем нейроны утреннего осциллятора считаются главными регуляторными нейронами, которые синхронизируют молекулярные часы в других нейронах посредством ритмического высвобождения нейропептида, фактора диспергирования пигмента (Pdf) (Top and Young, 2018; Renn et al. ., 1999; Хельфрих-Ферстер, 1995; Фернандес и др., 2008; Shafer et al., 2008). Однако сообщалось, что подмножество мутантов Pdf (~ 25%) сохраняло ритмическую активность с укороченным периодом (Grima et al., 2004), и более поздние эксперименты с участием клеточно-специфической экспрессии генов удлинения и сокращения периода показали, что что циркадные нейроны взаимодействуют через сложную сеть, а не иерархию, чтобы регулировать циркадное поведение (Yao et al., 2016; Yao and Shafer, 2014). Точная роль компонентов молекулярных часов в этих нейронах, регулирующих циркадный ритм, остается неясной.

Чтобы оценить роль компонентов молекулярных часов в конкретных часовых нейронах, исследователи обычно использовали систему Gal4-UAS для клеточно-специфической РНКи-нокдауна часовых генов и клеточно-специфического спасения у нулевого мутанта (Martinek and Young, 2000; Shafer и Тагерт, 2009). Хотя эти стратегии играют важную роль в понимании нейронального контроля циркадного поведения, они имеют ограничения. РНКи могут быть неэффективными: Мартинек и Янг наблюдали только ~ 50% снижение уровней РНК на при нокдауне специфичных для глаза РНКи на (Martinek and Young, 2000).Более того, в отличие от на нулевых мутантов, которые на 100% являются аритмичными, у мух с нокдауном на РНКи во всех клетках Tim + было показано, что только 45% аритмичны (Ng et al., 2011) или ритмичны с удлиненным периодом. (Мартинек и Янг, 2000). Точно так же эксперименты по спасению клеток иногда не воспроизводят ритмическое поведение дикого типа, возможно, из-за конститутивной экспрессии нормально ритмичных генов. Пан-нейронное или повсеместное спасение на или tim на фоне нулевых мутантов вызывало переменную ритмичность (~ 50–95%), в зависимости от вставки трансгена UAS и используемых линий драйверов Gal4; даже избыточная экспрессия на и tim на фоне дикого типа иногда приводила к частичной потере ритмичности (Yang and Sehgal, 2001).Таким образом, хотя эксперименты по удалению клеток показали необходимость конкретных нейронов для регуляции циркадной локомоторной активности, функция молекулярных часов в этих нейронах остается неясной.

Последние достижения в технологии CRISPR в Drosophila предоставили возможность создать новые инструменты для исследования циркадных ритмов (Gratz et al., 2013; Yu et al., 2013). Одним из ключевых достижений было создание мутаций потери функции (LOF) в соматических клетках посредством двуаллельного нацеливания на гены с использованием UAS-управляемой экспрессии фермента Cas9 под контролем Gal4 (Port et al., 2014). Вкратце, sgRNA (каркас Cas9 плюс направляющая РНК) направляет Cas9 к комплементарной последовательности целевой ДНК и катализирует двухцепочечный разрыв (DSB) (рис. 1B). Ремонт этого DSB происходит либо за счет точной гомологически направленной репарации (HDR), либо за счет более подверженного ошибкам негомологичного соединения концов (NHEJ) (Рисунок 1B). Если целевая последовательность восстановлена ​​правильно, механизм CRISPR снова нацелит ее на DSB. Если он будет исправлен неправильно, это может привести к небольшим вставкам или делециям (рисунок 1B), которые могут вызвать мутации со сдвигом рамки считывания, ранние стоп-кодоны и потерю функции (Port et al., 2014). Кроме того, размещение последовательностей тРНК между несколькими sgRNA в одном транскрипте позволяет их высвобождать эндогенным механизмом удаления тРНК и повышает эффективность разрушения генов (Port and Bullock, 2016). Напр., Когда Порт и Баллок использовали эту стратегию для экспрессии четырех уникальных sgRNAs вместе, ~ 100% области глаза проявляло фенотип LOF sepia , по сравнению только с 11-58% от каждой индивидуальной sgRNA, экспрессируемой отдельно. Таким образом, нацеливание нескольких уникальных sgRNA на один и тот же ген увеличивает вероятность достижения мутации LOF в этом гене (Port and Bullock, 2016).Наконец, экспрессия как фермента Cas9, так и последовательностей sgRNA из двух отдельных UAS-трансгенов уменьшала разрушение генов в тканях, не являющихся мишенями, вероятно, из-за низкой вероятности наличия достаточно неплотной экспрессии обоих UAS-трансгенов без присутствия Gal4 (Port and Bullock , 2016).

Здесь мы сгенерировали UAS-трансгены, экспрессирующие несколько sgRNA, которые нацелены либо на timeless , period , либо на контрольный ген ( acp ). Мы проверили эти конструкции, показав, что CRISPR-опосредованное нарушение гена tim или на повторяет нуль-мутантные фенотипы, когда они управляются всеми часовыми нейронами (Tim + клетки), но не в глии, и дополнительно подтвердили нарушение гена с помощью qRT. -ПЦР по циркадному циклу и иммуноокрашивание головного мозга.Затем мы нарушили молекулярные часы как в утреннем, так и в вечернем осцилляторах (Mai179 + ), только в утреннем осцилляторе (Pdf + ) или только в вечернем осцилляторе (Mai179 + Pdf ). . Эти эксперименты показали, что, хотя потеря молекулярных часов как в нейронах Pdf + (которые включают утренний осциллятор), так и в нейронах вечернего осциллятора, вызвала глубокую потерю циркадной локомоторной активности, потеря молекулярных часов в любом подмножестве нейронов по отдельности действительно нет.Это ставит под сомнение предположение о том, что внутренние молекулярные часы в утреннем осцилляторе необходимы для синхронизации активности других нейронов часов, а также предполагает, что циркадные нейроны действуют в распределенной сети, которая может компенсировать потерю молекулярных часов в определенных подмножествах.

Светящиеся в темноте часы с температурным дисплеем — Функциональность в помещении — По всему дому

Налог
Мы взимаем налог с продаж в AL, AR, AZ, CA, CO, CT, FL, GA, HI , IA, ID, IL, IN, KS, KY, LA, MA, MD, ME, MI, MN, MS, NC, ND, NE, NJ, NM, NV, NY, OH, OK, PA, RI, SC , SD, TN, TX, UT, VA, VT, WA, WI, WV, WY и DC в соответствии с требованиями закона.Государства, требующие налога с продаж, могут быть изменены. Мы оставляем за собой право взимать или взимать применимый налог с продаж для вашего заказа. Таким образом, ваша окончательная сумма налога с продаж может отличаться от той, которую вы видите на странице проверки заказа при оформлении заказа. Суммы налога с продаж для продуктов, услуг и доставки рассчитываются на основе адреса доставки заказа. Обратите внимание, что тип продукта, который вы покупаете, может влиять на ставку налога с продаж, дополнительный налог с продаж может взиматься местными органами власти, а законы о налогах с продаж часто меняются.

В штатах, где взимаются налоги с продаж или использования, ваша покупка облагается налогом, если только она не освобождена от налогообложения. Ваша покупка не подлежит освобождению только потому, что она совершена через Интернет, по каталогу или другим удаленным способом. Многие штаты требуют, чтобы покупатели подали налоговую декларацию с продаж / использования в конце года, сообщая обо всех налогооблагаемых покупках, которые не облагались налогом, и уплачивали налог с этих покупок.

Оставьте комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *